CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以来的第3代基因编辑技术。该技术自2013年迎来了高速发展时代。它利用含有与靶基因同源的sgRNA与Cas9共同作用切割靶基因。在基因敲除实验中，由于gRNA所介导的基因敲除效率难以预料，因此，高效gRNA的选择对于成功敲除基因是非常关键的。为了提高切割效率，科研工作者通常会设计3-5条gRNA，并筛选高效gRNA。无论是特异gRNA敲除效果的检测，还是高效gRNA的筛选，科研工作者均需要通过生物实验手段来验证。维真生物可根据您的实验需求提供个性化的基因敲除效果检测服务。
维真生物可采取多种方法帮客户检测特异gRNA敲除效果和筛选高效gRNA，具体信息详见下表：
| 服务编号 | 服务类型 | 规格 | 目录价 | 货期 |
|---|---|---|---|---|
| WZ100001-1 | 特异gRNA沉默效果检测 | 荧光检测 推荐！ 直接克隆测序 | 询价 | 咨询 |
| WZ100001-2 | 特异gRNA沉默效果检测 | PCR产物测序 | 询价 | 咨询 |
| WZ100002-1 | 高效gRNA筛选 | 荧光检测 推荐！ 直接克隆测序 | 询价 | 咨询 |
| WZ100002-2 | 高效gRNA筛选 | PCR产物测序 | 询价 | 咨询 |
*如您对上述服务感兴趣，请您点击“欢迎垂询”留下您的信息，我们将为您提供具体实验方案和项目价格。
敲除效果的常规检测方法是PCR产物测序的定性法和直接克隆测序的定量法。这两种方法受细胞类型的限制，它们是在基因组水平进行测量，故结果真实度比较高。尽管如此，它们在操作、实验周期和检测细胞类型方面就显得逊色。为了克服这些问题，维真生物建立了一套简捷和可重复的基因敲除效果检测系统——荧光法。
1. 操作简单；
2. 周期短，通常3个工作日即可完成；
3. 敲除效果检测不受细胞类型的限制；
4. 敲除效果直观、明了，通过EGFP是否发光检测敲除效果的发生；通过EGFP的发光强度定性敲除效率；
5. 实验结果可靠、重复性好。
下图是根据某基因设计多条gRNA序列，将pKO-Reporter和gRNA、Cas9质粒共转染HEK293，48h后观察的荧光结果：
| 检测方法 | 周期 | 定性/定量 | 真实度 | 细胞类型受限性 |
|---|---|---|---|---|
| PCR产物测序 | 较短，4-5个工作日 | 定性，根据套峰情况判断敲除效果和效率 | 好，基因组位点切割 | 受限制 |
| 直接克隆测序 | 长，10-15个工作日 | 定量，可计算敲除效率 | 好，基因组位点切割 | 受限制 |
| 荧光法 | 短，3个工作日 | 定性，根据荧光情况判断敲除效果和效率 | 较好，切割位点在外源质粒 | 不受限制 |
Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs) 转录激活样效应因子核酸酶是具有序列特异性的限制性内切酶，通过融合类转录激活因子效应物（TALE）的DNA结合结构域实现DNA双链的断裂，借助宿主细胞DNA修复机制，通过同源重组或非同源性末端连接 (NHEJ)进行DNA修复，从而产生Indel基因编辑效果。其作用原理见下图：
TALE是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白，能够识别特异性DNA碱基对。
1. 维真生物拥有一整套四聚体克隆，直接用来组装18碱基重复单元；
2. 可提供各种病毒载体；
3. 克隆全部经过全长序列测序；
4. 可提供敲除效果验证附加服务。
| 比较项 | TALEN | CRISPR-CAS9 |
|---|---|---|
| 识别靶序列模式 | Protein-DNA | RNA-DNA |
| 匹配靶序列模块 | 一个RVD(重复可变双残基)识别单个碱基 | RNA-DNA碱基互补配对 |
| 靶序列碱基数 | >16bp *2 | ~20bp |
| 脱靶率 | 低 | 有潜在脱靶性 |
| 多个基因同时敲除 | 不可以 | 可以 |
| 甲基化敏感 | 敏感 | 不敏感 |
| 适用物种 | 广泛 | 广泛 |
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