CRISPR/Cas9是继锌指核酸酶(ZFN)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)以来的第3代基因编辑技术。该技术自2013年迎来了高速发展时代。它利用含有与靶基因同源的sgRNA与Cas9共同作用切割靶基因。在基因敲除实验中，由于gRNA所介导的基因敲除效率难以预料，因此，高效gRNA的选择对于成功敲除基因是非常关键的。为了提高切割效率，科研工作者通常会设计3-5条gRNA，并筛选高效gRNA。无论是特异gRNA敲除效果的检测，还是高效gRNA的筛选，科研工作者均需要通过生物实验手段来验证。维真生物可根据您的实验需求提供个性化的基因敲除效果检测服务。
维真生物可采取多种方法帮客户检测特异gRNA敲除效果和筛选高效gRNA，具体信息详见下表：
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服务编号 |
服务类型 |
规格 |
目录价 |
货期 |
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WZ100001-1 |
特异gRNA沉默效果检测 |
荧光检测 推荐！ 直接克隆测序 |
询价 |
咨询 |
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WZ100001-2 |
特异gRNA沉默效果检测 |
PCR产物测序 |
询价 |
咨询 |
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WZ100002-1 |
高效gRNA筛选 |
荧光检测 推荐！ 直接克隆测序 |
询价 |
咨询 |
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WZ100002-2 |
高效gRNA筛选 |
PCR产物测序 |
询价 |
咨询 |
*如您对上述服务感兴趣，请您点击“欢迎垂询”留下您的信息，我们将为您提供具体实验方案和项目价格。
相关服务： CRISPR-Cas9克隆 腺病毒包装 慢病毒包装 腺相关病毒包装 KO细胞系建立
敲除效果的常规检测方法是PCR产物测序的定性法和直接克隆测序的定量法。这两种方法受细胞类型的限制，它们是在基因组水平进行测量，故结果真实度比较高。尽管如此，它们在操作、实验周期和检测细胞类型方面就显得逊色。为了克服这些问题，维真生物建立了一套简捷和可重复的基因敲除效果检测系统——荧光法。
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优势 |
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1. 操作简单； 2. 周期短，通常3个工作日即可完成； 3. 敲除效果检测不受细胞类型的限制；
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4. 敲除效果直观、明了，通过EGFP是否发光检测敲除效果的发生；通过EGFP的发光强度定性敲除效率； 5. 实验结果可靠、重复性好。 |
下图是根据某基因设计多条gRNA序列，将pKO-Reporter和gRNA、Cas9质粒共转染HEK293，48h后观察的荧光结果：
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PCR产物测序、直接克隆测序和荧光法的比较
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检测方法 |
周期 |
定性/定量 |
真实度 |
细胞类型受限性 |
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PCR产物测序 |
较短，4-5个工作日 |
定性，根据套峰情况判断敲除效果和效率 |
好，基因组位点切割 |
受限制 |
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直接克隆测序 |
长，10-15个工作日 |
定量，可计算敲除效率 |
好，基因组位点切割 |
受限制 |
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荧光法 |
短，3个工作日 |
定性，根据荧光情况判断敲除效果和效率 |
较好，切割位点在外源质粒 |
不受限制 |
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TALEN
Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs) 转录激活样效应因子核酸酶是具有序列特异性的限制性内切酶，通过融合类转录激活因子效应物（TALE）的DNA结合结构域实现DNA双链的断裂，借助宿主细胞DNA修复机制，通过同源重组或非同源性末端连接 (NHEJ)进行DNA修复，从而产生Indel基因编辑效果。其作用原理见下图：
TALE(TAL effectors，类激活因子效应物)：
TALE是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的蛋白，能够识别特异性DNA碱基对。
设计策略：
应用示例——腺相关病毒在人源基因组中整合位点AAVS1的基因编辑
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比较项 |
TALEN |
CRISPR-CAS9 |
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识别靶序列模式 |
Protein-DNA |
RNA-DNA |
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匹配靶序列模块 |
一个RVD(重复可变双残基)识别单个碱基 |
RNA-DNA碱基互补配对 |
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靶序列碱基数 |
>16bp *2 |
~20bp |
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脱靶率 |
低 |
有潜在脱靶性 |
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多个基因同时敲除 |
不可以 |
可以 |
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甲基化敏感 |
敏感 |
不敏感 |
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适用物种 |
广泛 |
广泛 |
400-077-2566
service@wzbio.cn
