衣壳修饰的工程化AAV

1.研究背景

基因治疗是一种新型的治疗手段，它可以治疗多种疾病，包括癌症、遗传性疾病、神经性疾病、感染性疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病等，它针对的是疾病的根源而不仅仅是疾病的症状。如此有效的治疗方法有什么特殊性呢？其实很简单，它就是将外源正常基因借助一定的技术或者载体导入靶细胞，从而纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病，以达到治疗疾病的目的（图1）。

图1：基因治疗的示意图（来源于：https://www.fda.gov/）

实现基因治疗成功的关键是载体的选择。在众多载体工具中，腺相关病毒载体(Adeno-Associated Viral Vector, AAV Vector)凭借其安全性高、免疫原性低和表达时程长的优势成为当下基因治疗中极具市场前景的病毒载体，从而被越来越多的临床试验用于治疗各种疾病。截止目前，已有3款基于AAV载体的基因药物被获批上市（图2）：第一款是2012年由欧洲药品管理局（EMA）批准的GLYBERA® (alipogene tiparvovec, AT)，该药物由荷兰UniQure公司研制，用于治疗脂蛋白脂酶缺乏症（LPLD）；第二款是2017年由美国食品药品监督管理局（FDA）批准的LUXTURNA®(voretigene neparvovec-rzyl, VN)，次年又被EMA获批，该药物由美国Spark Therapeutics公司研制，用于治疗Leber先天性黑蒙症II型；第3款是2019年同样由FDA批准的ZOLGENSMA® (onasemnogene abeparvovec-xioi, OA) ，该药物由美国AveXis公司研制，用于治疗2岁以下患儿的脊髓性肌萎缩症I型。

图2：3款获批上市的基于AAV载体的基因药物的时间表
(Lugin, M. L., et al. (2020). ACS Nano 14(11): 14262-14283.)

上述取得的成就，再加上美国临床试验数据库（ClinicalTrials.gov）中的一系列临床前和临床研究均证实了AAV载体的安全性和有效性。但是野生型AAV毕竟不是为了递送疾病治疗基因而进化的。而且，体内预存的中和抗体和AAV载体的承载能力进一步限制了AAV载体的广泛应用。目前，科学家们研究的重点主要集中在工程化AAV载体，用于提高其安全性、靶向性和转导效率。工程化AAV载体的构建方法多种多样，本篇我们将重点跟大家分享衣壳修饰的工程化AAV载体（图3）。

图3：工程化AAV载体的示意图

2.AAV基因组结构

了解AAV基因组结构是构建工程化AAV的基础。野生型AAV含有约4.7kb的单链线性DNA基因组，三个基因Rep, Cap和X的两端各由145bp的ITR组成，可形成T型的发夹结构（图4）。Rep基因编码病毒转录调控、复制和包装必需的四个调控蛋白：Rep78, Rep68, Rep52 和Rep40。Cap基因编码三个重叠的结构蛋白（VP1, VP2, VP3，其表达比例为1:1:10）和VPs入核必需的装配激活蛋白AAP（assembly-activating protein）。X基因编码基因组复制中具有支持功能的蛋白质。

图4：AAV2载体的基因组结构
（Buning, H. and A. Srivastava (2019). Mol Ther Methods Clin Dev 12: 248-265.）

对于Cap基因，我们从基因组的VPs基因分布上就可以看出，VP3被全部包含在VP2和VP1中，因此，VP3就是3个VPs的共同区域，也被称为VP3公共区；VP2较VP3长约57个氨基酸的序列，且该序列被包含在VP1中，因此，也叫VP1/VP2公共区；只有VP1 N端独有大约138个氨基酸的序列，因此，也叫VP1独特区（VP1u）。VP3公共区负责组装二十面体衣壳；VP1u含有磷脂酶A2结构域，VP1u和VP1/VP2公共区含有核定位序列NLSs，因此，VP1u和VP1/VP2公共区负责内体运输&逃离、核定位和基因组释放。

3.AAV衣壳结构

AAV衣壳结构的解析有助于理解AAV如何感染细胞和确定工程化AAV衣壳修饰的位置。腺相关病毒的衣壳呈T=1二十面体（二十面体是由20个三角形围成的凸多面体，每5个三角形围出一个五倍顶，通过每一对相对着的五倍顶有一个五倍旋转轴；通过每一对相对着的三角形中心有1个三倍旋转轴；通过每一对相对着的棱的中点有1个二倍旋转轴）。它由60个VP单体通过这些旋转轴的相互作用装配而成，这些VP单体可以全部为VP3，也可以由VP1、VP2、VP3共同构成。
AAV衣壳表面的显著特征是二倍凹地，三倍凸起和五倍通道（图5）。圆柱形通道连通衣壳内外，是AAV DNA进入衣壳的地方，它参与 Rep 蛋白结合、衣壳蛋白装配、VP1 N 末端外露、AAV病毒感染等多个过程；二倍凹地是病毒衣壳最薄的地方；三倍凸起的主要作用是识别受体。

图5：由60个VP3装配成的AAV2衣壳的拓扑结构
（Tseng, Y. S. and M. Agbandje-McKenna (2014). Front Immunol 5: 9.）

每个衣壳蛋白的拓扑结构由一个保守的α螺旋（αA）和一个由8股反向平行链（βB-βI）构成的β桶核心组成（图6）。在8股反向平行链之间存在4个大的链间环（BC，DE，GH，HI，根据环所在位置命名），这些环构成衣壳的外表面。其中，GH环是较大的环，又可以分为多个亚环。这些亚环在主要的衣壳组分VP3中具有较高的序列和结构可变性，经鉴定包含9个可变区（variable regions; VRs），这些VRs在不同的血清间存在差异，主要在受体附着、组织转导和抗原性方面起作用。

图6：AAV2 VP3单体的拓扑结构。9个VRs被用不同的颜色标记：
I，紫色；II，蓝色；III，黄色；IV，红色；V，黑色；VI，粉红色；VII，青色；VIII，绿色；IX，巧克力色
（Gurda, B. L., et al. (2013). J Virol 87(16): 9111-9124.）

4.衣壳修饰的工程化AAV

特定的VP亚基已被作为衣壳修饰的靶点，例如去除免疫原基序，整合标签或荧光基团和重新靶向等。
AAV2是研究相对成熟的血清型。以AAV2为骨架，在公共VP3区，大量研究表明，I-587（VP1氨基酸数）和I-588为较常用的衣壳修饰位置，因为这2个位置地处三倍凸起附近，可以接受长达34个氨基酸长度的肽链插入，而不影响衣壳化和基因组包装。而且，外源肽链的插入使得AAV2第一受体结合基序被修饰，最终赋予AAV2变体新的靶向性。Buning, H.等人汇总了在I-587和I-588处插入肽链的AAV2变体（表1）。维真生物现拥有表1所列的所有AAV Cap质粒，数量近70种，可直接进行AAV病毒包装。

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表1：在I-587和I-588处插入肽链的AAV2变体

Serotype	Position	Name	Target Cell Type	Insert
AAV2	I-587	AAV-I-587	β1-integrin positive tumor cells	QAGTFALRGDNPQG
AAV2	I-587	AAV-588NGR	CD13-positive tumor cells	NGRAHA
AAV2	I-587	AAV-MO7A	tumor cells	RGDAVGV
AAV2	I-587	AAV-MO7T	tumor cells	RGDTPTS
AAV2	I-587	AAV-MecA	tumor cells	GENQARS
AAV2	I-587	AAV-MecB	tumor cells	RSNAVVP
AAV2	I-587	rRGD587	αv integrin positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-587	AAV-C4	tumor cells	PRGTNGP
AAV2	I-587	AAV-D10	tumor cells	SRGATTT
AAV2	I-587	AAV-SIG	endothelial cells	SIGYPLP
AAV2	I-587	AAV-MTP	endothelial cells	MTPFPTSNEANL
AAV2	I-587	AAV-QPE	endothelial cells	QPEHSST
AAV2	I-587	AAV-VNT	endothelial cells	VNTANST
AAV2	I-587	AAV-CNH	endothelial cells	CNHRYMQMC
AAV2	I-587	AAV-CAP	endothelial cells	CAPGPSKSG
AAV2	I-587	AAV-EYH	smooth muscle cells	EYHHYNK
AAV2	I-587	AAV587MTP	skeleton muscle cells	ASSLNIA
AAV2	I-587	AAV-r3.45	neuronal stem cells	TQVGQKT
AAV2	I-587	AAV2-LSS	CNS	LPSSLQK
AAV2	I-587	AAV2-PPS	CNS	DSPAHPS
AAV2	I-587	AAV2-TLH	CNS	GWTLHNK
AAV2	I-587	AAV2-GMN	CNS	GMNAFRA
AAV2	I-587	AAV-Kera1	keratinocytes	RGDTATL
AAV2	I-587	AAV-Kera2	keratinocytes	PRGDLAP
AAV2	I-587	AAV-Kera3	keratinocytes	RGDQQSL
AAV2	I-587	AAV-588Myc	none	EQLSISEEDL
AAV2	I-587	AAV2.N587_R588insBAP	adaptor	GLNDIFEAQKIEWHE
AAV2	I-587	AAV2Ald13	adaptor	LCTPSRAALLTGR
AAV2	I-587	DMD4	vaccine	QVSHWVSGLAEGSFG
AAV2	I-587	DMD6	vaccine	LSHTSGRVEGSVSLL
AAV2	I-588	A588-RGD4C	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-588	A588-RGD4CGLS	av-integrin positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-588	AAV-VTAGRAP	tumor cells	VTAGRAP
AAV2	I-588	AAV-APVTRPA	tumor cells	APVTRPA
AAV2	I-588	AAV-DLSNLTR	tumor cells	DLSNLTR
AAV2	I-588	AAV-NQVGSWS	tumor cells	NQVGSWS
AAV2	I-588	AAV-EARVRPP	tumor cells	EARVRPP
AAV2	I-588	AAV-NSVSLYT	tumor cells (CML)	NSVSLYT
AAV2	I-588	AAV-LS1	tumor cells (CML), CD34+cells	NDVRSAN*
AAV2	I-588	AAV-LS2	tumor cells (CML), CD34+cells	NESRVLS
AAV2	I-588	AAV-LS3	tumor cells (CML), CD34+cells	NRTWEQQ
AAV2	I-588	AAV-LS4	tumor cells (CML), CD34+cells	NSVQSSW
AAV2	I-588	AAV-RGDLGLS	tumor cells	RGDLGLS
AAV2	I-588	AAV-RGDMSRE	tumor cells	RGDMSRE
AAV2	I-588	AAV-ESGLSQS	tumor cells	ESGLSQS
AAV2	I-588	AAV-EYRDSSG	tumor cells	EYRDSSG
AAV2	I-588	AAV-DLGSARA	tumor cells	DLGSARA
AAV2	I-588	AAV-GPQGKNS	tumor cells	GPQGKNS
AAV2	I-588	AAV-NSSRDLG	endothelial cells	NSSRDLG
AAV2	I-588	AAV-NDVRAVS	endothelial cells	NDVRAVS#
AAV2	I-588	AAV-PRSTSDP	lung (maybe endothelial cells)	PRSTSDP
AAV2	I-588	AAV-DIIRA	endothelial cells	DIIRA
AAV2	I-588	AAV-SYENV	endothelial cells	SYENVASRRPEG
AAV2	I-588	AAV-PENSV	endothelial cells	PENSVRRYGLEE
AAV2	I-588	AAV-LSLAS	endothelial cells	LSLASNRPTATS
AAV2	I-588	AAV-NDVWN	endothelial cells	NDVWNRDNSSKRGGTTEAS
AAV2	I-588	AAV-NRTYS	endothelial cells	NRTYSSTSNSTSRSEWDNS
AAV2	I-588	rAAV2-ESGHGYF	pulmonary endothelial cells	ESGHGYF
AAV2	I-588	AAV-GQHPRPG	cardiomyoblasts	GQHPRPG+
AAV2	I-588	AAV-PSVSPRP	cardiomyoblasts	PSVSPRP
AAV2	I-588	AAV2-VNSTRLP	cardiomyoblasts	VNSTRLP
AAV2	I-588	AAV-LSPVR	cardiomyoblasts	LSPVRPG
AAV2	I-588	AAV-MSSDP	cardiomyoblasts	MSSDPRRPPRDG
AAV2	I-588	AAV-GARPS	cardiomyoblasts	GARPSEVTTRPG
AAV2	I-588	AAV-GNEVL	cardiomyoblasts	GNEVLGTKPRAP
AAV2	I-588	AAV-KMRPG	cardiomyoblasts	KMRPGAMGTTGEGTRVTRE
AAV2	I-588	AAV588MTP	skeleton muscle	ASSLNIA

除了I-587和I-588外，I-453、I-520&I-584、I-584、I-585也已被成功用于开发新细胞靶向性工程化AAV（表2）。

表2：非I-587和I-588衣壳变体

Serotype	Position	Name	Target Cell Type	Insert
AAV2	I-453	rRGD453ko	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-453	AAV-MNVRGDL	endothelial cells	MNVRGDL
AAV2	I-453	AAV-ENVRGDL	endothelial cells	ENVRGDL
AAV2	I-520 and I-584	A520/N584 (RGD)	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-584	A584-RGD4C	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-584	A584-RGD4CALS	av integrin-positive tumor cells	CDCRGDCFC
AAV2	I-585	AAV-∆IV-NGR	CD13-positive tumor cells	NGRAHA
AAV2	I-585	AAV-PTP	Plectin-positive tumor cells	KTLLPTP

正如研究背景中所述，体内预存中和抗体是限制AAV广泛临床应用的一大障碍。血清学研究表明，大多数人都接触过野生型AAV，因此体内可能已经形成针对AAV的中和抗体。这些中和抗体可能会干扰AAV进入靶细胞、细胞内运输和细胞核内的解包装，从而阻止了转导。据报道，抗AAV抗体在人群中的流行率约为40-80%。其中，抗AAV2的中和抗体在人群中相对更流行。为了克服这个障碍，科学工作者以其他低免疫原性血清型为骨架，并参考AAV2的衣壳修饰位点，开发了一系列新的工程化AAV（表3）。

表3：非AAV2骨架的工程化AAV

Serotype	Position	Name	Target Cell Type	Insert
AAV1	I-590	BAP-AAV1	Scavidin displaying BT4C (rat glioma)	GLNDIFEAQKIEWHE
AAV1	I-590	BAP-AAV1	endothelial cells	GLNDIFEAQKIEWHE plus CDCRGDCFC(RGD4C)
AAV1	I-590	AAV1-RGD	tumor cells, endothelial cells	CDCRGDCFC
AAV1	I-590	AAV1-RGD/BAP (90/10) (mosaic capsid)	tumor cells, endothelial cells	CDCRGDCFC and GLNDIFEAQKIEWHE
AAV1	I-590	Tet1c-AAV1 (mosaic capsid)	tetanus toxin GT1b receptor positive cells	HLNILSTLWKYR
AAV1	I-590a	AAV1.9-3-SKAGRSP	fibroblast	SKAGRSP
AAV5	I-575	BAP-AAV4	tumor cells	GLNDIFEAQKIEWHE
AAV6	I-585	AAV6-RGD	tumor cells	RGD
AAV6	I-585 plus Y705-731F+T492V	AAV6-RGD-Y705-731F+T492V	tumor cells	RGD
AAV6	I-585plus Y705-731F+T492V+K531E	AAV6-RGD-Y705-731F+T492V+K531E	tumor cells	RGD
AAV8	I-585c	AAV2/8-BP2	on-bipolar cells	PERTAMSLP
AAV8	I-590	AAV8-ESGLSOS	tumor cells	ESGLSOS135
AAV8	I-590	AAV8-ASSLNIA	heart (weakly improved transduction)	ASSLNIA122
AAV8	I-590d	AAV8-GQHPRPG	heart (weakly improved transduction)	GQHPRPG86
AAV8	I-590d	AAV8-SEGLKNL	liver	SEGLKNL
AAV9	I-589	AAV-SLRSPPS	endothelial cells, smooth muscle cells	SLRSPPS
AAV9	I-589	AAV-RGDLRVS	endothelial cells, smooth muscle cells	RGDLRVS
AAV9	I-589d	AAV9-NDVRAVS	endothelial cells	NDVRAVS82
AAV9	I-589d	AAV9-ESGLSOS	tumor cells (weak targeting)	ESGLSOS135
AAV9	I-588	AAV-PHP.B	CNS	TLAVPFK
AAV9	I-588	AAV-PHP.A	CNS	YTLSQGW
AAV9	I-588	AAV9-7m8	retinal cells	LGETTRP80
AAV9P1	not disclosed	AAV9P1	neuronal progenitor cells	RGDLGLS

如若了解靶向同一类细胞的所有血清型间的效果差异，请参考Reference 2中对应的参考文献。

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5.结束语

目前AAV基因药物的临床研究大多数采用的是天然的衣壳，这些衣壳极易成为宿主酶的作用靶点，从而影响它们的整体性能。此外，天然AAV血清型具有组织亲噬性，但通常趋向性比较广泛。因此，必须使用高剂量的病毒才能达到治疗效果。而且，AAV载体的包装容量和大多数人群中已存的中和抗体进一步限制了AAV的临床应用。为了克服这些限制，科学工作者将研究的重点聚焦在工程化AAV，以进一步提高其安全性、有效性和特异性，从而推动基因治疗领域的快速发展。在当今基因治疗的研究热潮下，为了加快您的科研进程，我们建立了工程化AAV库，旨在为基因治疗的发展贡献自己的一份力。

6.参考文献

1. Lugin, M. L., et al. (2020). "Synthetically Engineered Adeno-Associated Virus for Efficient, Safe, and Versatile Gene Therapy Applications." ACS Nano 14(11): 14262-14283.
2. Buning, H. and A. Srivastava (2019). "Capsid Modifications for Targeting and Improving the Efficacy of AAV Vectors." Mol Ther Methods Clin Dev 12: 248-265.
3. Pipe, S., et al. (2019). "Clinical Considerations for Capsid Choice in the Development of Liver-Targeted AAV-Based Gene Transfer." Mol Ther Methods Clin Dev 15: 170-178.
4. Tseng, Y. S. and M. Agbandje-McKenna (2014). "Mapping the AAV Capsid Host Antibody Response toward the Development of Second Generation Gene Delivery Vectors." Front Immunol 5: 9.
5. Gurda, B. L., et al. (2013). "Capsid antibodies to different adeno-associated virus serotypes bind common regions." J Virol 87(16): 9111-9124.