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分裂筛选标记慢病毒系统


背景介绍

在科研和细胞工程等领域中构建稳定表达细胞株,经常需要实现多个基因的稳定共表达,目前常用的策略是多重感染、多重分离筛选等,然而这种方式存在很多弊端:①真核细胞中可使用筛选标记数量有;②实验周期长;③同时使用多个不同的筛选基因可能对细胞产生不利影响;④多基因串联,病毒包装效率低等;以上问题为筛选多基因共表达的稳转株在时间和成本等方面提出了挑战。因此,有必要开发新的技术手段解决以上问题。

维真生物建立了一种可简单快速地实现多基因共表达的分裂筛选系统!



分裂筛选标记原理

将一种筛选标记分成N端和C端两部分,分别连接内含子剪接接头TS1和TS2,构建到两个慢病毒载体中,然后将两个载体进行细胞转导,部分细胞在此过程中“一无所获”,部分细胞会“摄取”其中一种载体,部分细胞会“摄取”两种载体。只有当含有N端和C端筛选标记的两个载体同时被一个细胞“摄取”时,在mRNA水平N-筛选标记和C-筛选标记才会连接成一个完整的筛选标记,从而表达完整的筛选标记蛋白。而那些没有“摄取”到载体,或者只“摄取”到一种载体的细胞(即N端和C端筛选标记的两个载体没有进入一个细胞),该细胞内由于无法表达一个完整的筛选标记蛋白,从而被淘汰。




图1. 分裂筛选标记原理示意图



研发路线





双载体图谱



图2. 慢病毒双载体图谱



利用分裂筛选标记慢病毒系统快速高效地制备IPS细胞

诱导性多能干细胞(IPS cells)是指通过基因转染技术(gene transfection)将某些转录因子导入动物或人的体细胞,将终末分化的体细胞重编程为胚胎干细胞(ESC)细胞样的多潜能细胞。现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内,来获得多能性干细胞。2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究,他们把Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体,然后引入小鼠成纤维细胞,发现可诱导其发生转化,产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

然而,目前研究人员用来产生诱导性多能干细胞的方法耗时长且效率低,当把四种转录因子导入成体细胞如皮肤细胞中时,利用上千个皮肤细胞最终只能获得几个iPSCs。因此,我们尝试利用新建立的分裂筛选标记的慢病毒稳转系统同时表达以上四种转录因子,在短时间内获得稳转细胞系。





图3. 利用分裂筛选标记慢病毒稳转系统筛选IPS稳转细胞系

实验方案与结果

首先,我们将四种转录因子分成两组分别构建到前面所述的双慢病毒载体中,得到pLent-Ef1a-Oct4-P2A-Sox2-cmv-N-Puro(简称IPS-N-Puro)和pLent-Ef1a-Klf4-P2A-Myc-cmv-C-Puro(简称IPS-C-Puro)的慢病毒质粒。随后将这两个慢病毒质粒共转到293A细胞中,通过Puro筛选,观察细胞生长情况。如下图所示设置实验组与对照组,我们发现在Puro加压后空细胞组细胞大量死亡,而实验组与对照组中细胞存活率较高。这一结果说明,大量的双慢病毒载体进入了同一细胞中,抗生素基因得到了正常表达,大量细胞得以存活下来






随后,我们对实验组与对照组细胞中四种转录因子mRNA水平的表达情况进行了定量检测,如下图所示,我们发现实验组细胞中四种转录因子的mRNA表达量都要明显高于GFP对照组,这一结果同样佐证了上述结论,有大量的双慢病毒载体进入了同一细胞中,四种转录因子实现了高表达





接着,我们将上述两个慢病毒载体分别包装成慢病毒,进行293A细胞的共感染,如下图所示设置实验组和对照组,感染72小时后,加Puro进行筛选,我们发现,空白组细胞(5)和单一慢病毒感染组(2、3)的细胞,出现大量死亡,而“摄取”到双病毒的实验组(1)和GFP组(4),细胞存活率明显高于两病毒单独感染组,在筛选一周后我们成功获得了大量稳转株细胞。



慢病毒

载体

滴度

IPS-N-Puro

pLent-Ef1a-Oct4-P2A-Sox2-cmv-N-Puro

7.19E+08 IU/ml

IPS-C-Puro

pLent-Ef1a-Klf4-P2A-Myc-cmv-C-Puro

1.87E+09 IU/ml






同样地,我们对两病毒共感染组与GFP慢病毒对照组中细胞中的四种转录因子mRNA水平的表达情况进行了定量检测,结果与质粒转染所得结果基本一致,两病毒共感染组细胞中四种转录因子的mRNA表达量都要明显高于GFP对照组,结果同样验证了上述结论,四基因共表达的稳转株细胞构建成功。






小结

维真生物成功建立了一种可实现分裂筛选标记的慢病毒稳转系统,能够利用一个筛选标记选择多个转基因,使多基因的共同表达更加简单方便,并且能在短时间内进行多基因的稳转细胞系构建。目前,我们已经利用该系统成功获得了四种转录因子稳定表达的诱导性多能干细胞的稳转细胞株。此外,该系统还可以在CRISPR/Cas9基因组编辑中,用于双转基因或双等位基因敲除的阳性细胞选择。


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