双荧光素酶报告基因检测服务

荧光素酶（luciferase）是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，可以催化荧光素氧化成氧化荧光素，在氧化过程中发出生物荧光。荧光素酶以出色的灵敏度、使用方便、可定量检测成为理想的报告基因。荧光素酶的种类很多，其中应用较为广泛的是萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，FLUC）和海肾荧光素酶（Renilla luciferase，RLUC）。

双荧光素酶催化发光原理

■ 萤火虫荧光素酶是一个61kD的单体酶，不需要表达后修饰即可获得酶活性，其催化的发光反应必须要有ATP和荧光素的参与，在ATP、Mg²⁺和O₂存在的条件下，荧光素在荧光素酶的催化下氧化产生黄绿光，波长540-600nm。

■ 海肾荧光素酶是一个36kD的单体酶，同样不需要表达后修饰即可产生酶活性，只需要O₂即可催化腔肠素氧化发出蓝光，波长460-540nm。

双荧光素酶报告基因系统

由于萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的催化底物和发光颜色不同，且光吸收波长不同，可在互不干扰的情况下进行检测，此外，在哺乳动物体内两种酶均无内源性表达，因此作为双荧光素酶报告基因系统得到广泛使用。在双荧光素酶检测中，通常以萤火虫荧光素酶为实验报告基因，以海肾荧光素酶为对照报告基因，以减少细胞活性、转染效率等外在变化因素对实验准确性的影响。

1、检测方法

将萤火虫荧光素酶报告基因质粒与带有海肾荧光素酶基因的质粒共转染细胞，或者将两种报告基因构建到同一载体上，用不同的启动子启动其表达，通过计算萤火虫荧光素酶检测值与海肾荧光素酶检测值的比值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），分析荧光素酶的表达水平。

2、应用场景

双荧光素酶报告基因系统凭借灵敏度高、检测范围广、方便快速的优势，已成为基因转录调控、启动子结构分析、启动子SNP分析和非编码RNA靶向互作等研究的重要手段。

★维真生物双荧光素酶检测服务★

服务内容一：启动子与转录因子互作检测

将靶启动子片段插入到萤火虫荧光素酶表达序列上游，构建实验报告基因质粒，将要检测的转录因子表达质粒与两种报告基因质粒共转染相关细胞；经细胞培养后裂解细胞，离心取上清，随后分别加入两种荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应产生荧光，通过检测荧光的强度测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否与该启动子存在相互作用。

备注：如果转录因子能够激活靶启动子，则萤火虫荧光素酶基因就会表达，且萤火虫荧光素酶的表达水平与转录因子的作用强度成正比。

启动子与转录因子互作检测示意图

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服务内容二：miRNA-靶基因调控验证

miRNA通过识别mRNA的3’UTR区，诱导细胞内沉默复合体介导的mRNA降解或抑制mRNA的翻译过程。将野生型或突变型待测靶基因的3’UTR序列构建至萤火虫荧光素酶基因的3’端，将两个报告基因质粒与miRNA在细胞内共表达，通过比较萤火虫荧光素酶报告基因表达活性的改变，验证miRNA对靶基因的调控作用。

备注：若萤光素酶的活性降低，提示miRNA可能参与抑制靶基因的表达。

miRNA与靶基因调控验证示意图

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服务流程：

启动子与转录因子互作检测

miRNA与靶基因调控验证