Cell Death & Disease (IF 9.0)｜山东省肿瘤医院张松团队揭示METTL3在结直肠癌中的致癌机制
N6-甲基腺苷（m6A）是一种在哺乳动物信使RNA中普遍存在的内部修饰，占RNA修饰的80%以上。据报道，m6A修饰涉及一系列生物学过程，包括干细胞自我更新和分化、DNA损伤修复、免疫调节、性别决定等。除了正常的生理活动外，m6A还与包括癌症在内的多种疾病的发病机制有关。METTL3是一种甲基转移酶，具有致癌作用，已知由METTL3介导的m6A修饰在几种癌症中的作用已被阐明，但其在结直肠癌中发挥功能的具体机制仍不清楚。
2023年11月，山东第一医科大学附属肿瘤医院张松研究团队在Cell Death & Disease (IF 9.0)上发表“METTL3 promotes colorectal cancer progression through activating JAK1/STAT3 signaling pathway”文章。研究揭示了METTL3具有作为m6A“写入器”和转录调节因子的双重作用，通过m6A/YTHDF1轴上调JAK1的表达，同时协同NF-κB增强STAT3转录，导致STAT3信号通路激活和结直肠癌进展。
研究结果与方法
1、METTL3在结直肠癌细胞中表达上调并发挥促癌作用
采用蛋白质印迹、免疫组化染色并结合生物信息学分析，研究人员发现结直肠癌组织中m6A和METTL3的表达均上调。为了进一步阐明METTL3介导的m6A靶向基因调控的机制，使用慢病毒介导的shRNA转染建立了METTL3稳定降低的结直肠癌细胞系HCT116和LoVo细胞。集落形成、MTT测定以及Transwell分析显示，METTL3敲低显著抑制了癌细胞的增殖及迁移，流式细胞术检测发现多数METTL3沉默的细胞其周期停滞在G1/G0期，但细胞凋亡没有发生明显变化。因此，METTL3可能通过调节细胞周期和迁移来发挥促癌作用，但不依赖于细胞凋亡控制。
图1. METTL3在结直肠癌细胞中的促癌作用
2、METTL3沉默对JAK1/STAT3信号通路的影响
斑点杂交结果显示METTL3沉默的癌症细胞中RNA m6A水平显著降低，随后对METTL3缺失或对照HCT116细胞进行了甲基化RNA免疫沉淀和RNA测序（MeRIP-seq），途径富集统计发现JAK/STAT信号通路表达差异显著。WB结果表明METTL3沉默显著抑制了STAT3的磷酸化，并明显降低JAK1和STAT3的表达。研究人员利用携带CRISPR/Cas9系统的慢病毒载体构建了METTL3敲除的HCT116细胞（KO-C4、KO-C7），实时PCR研究发现，METTL3基因敲除在mRNA水平上显著下调STAT3的表达，但对JAK1 mRNA的表达没有影响；外源性过表达野生型METTL3（WT-METTL3）和突变体METTL3 (D395A/W398A)，发现野生型或突变型METTL3过表达均挽救了STAT3的表达，但只有WT-METTL3挽救了JAK1的表达，而突变型METTL3过表达未能挽救JAK1的表达。上述数据表明，METTL3以m6A依赖的方式在蛋白质水平而不是mRNA水平上调节JAK1的表达，并影响STAT3 mRNA的表达，这共同促进了结直肠癌细胞JAK1/STAT3信号通路的激活。
图2. METTL3沉默对JAK1/STAT3信号通路的影响
3、YTHDF1以m6A依赖的方式促进JAK1 mRNA翻译
大量证据表明，YTHDF1能够通过识别靶RNA的m6A 位点促进其翻译。研究者利用慢病毒载体构建了YTHDF1沉默的HCT116细胞系，蛋白质印迹研究显示，YTHDF1敲低可有效抑制STAT3磷酸化，并降低JAK1的表达水平，但对STAT3的表达没有影响。RIP和定量实时PCR分析发现JAK1 mRNA在YTHDF1免疫沉淀物中富集，并且在METTL3敲除后，这种相互作用明显减弱，表明m6A在YTHDF1和JAK1 mRNA的相互作用中具有不可或缺性。此外，YTHDF1的沉默显著抑制了细胞增殖、迁移，上述数据表明，METTL3依赖YTHDF1与JAK1 m6A位点的结合能力来促进JAK1翻译，导致STAT3途径激活和癌症进展。
进一步分析发现METTL3和NF-κB协同促进STAT3的转录，STAT3信号通路在METTL3介导的结直肠癌细胞增殖和迁移中起着重要作用。
图3. YTHDF1以m6A依赖的方式促进JAK1 mRNA的翻译
4、METTL3和YTHDF1在体内促进肿瘤生长和转移
最后，为了探讨METTL3在体内调节肿瘤发生的作用，将METTL3缺失或非缺失的结直肠癌细胞皮下注射到BALB/c裸鼠中，结果显示METTL3的敲除有效地延缓了肿瘤生长。利用肺转移小鼠模型检测发现尾静脉注射METTL3非缺失的HCT116对照细胞导致严重的肺转移，而METTL3的缺失几乎完全消除了转移性淋巴结的形成。进一步将YTHDF1缺失的癌症细胞注射到裸鼠中，以建立荷瘤和肺转移小鼠模型，YTHDF1沉默后，肿瘤负荷明显减轻，肺组织中的转移结更少。此外，在METTL3或YTHDF1缺失的异种移植物中，STAT3信号相关蛋白的表达水平均降低。上述研究结果表明，METTL3以m6A依赖性和非依赖性的方式同时上调JAK1和STAT3的表达，这有助于STAT3信号激活，导致癌症在体外和体内的增殖和进展。
图4. METTL3和YTHDF1在体内促进肿瘤生长和转移
小结
本研究表明METTL3通过以m6A依赖性和非依赖性的方式上调JAK1和STAT3的表达，有助于p-STAT3信号通路的激活并促进结直肠癌的进展。因此，同时抑制p-STAT3和METTL3可能为结直肠癌治疗开辟新的前景。
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