Nat Commun：南方医科大学高天明教授团队揭示星形胶质细胞来源的ATP调控自闭症的作用机制

近日，南方医科大学高天明教授带领团队在Nature Communications（IF=14.919）上发表了题为“Impaired calcium signaling in astrocytes modulates autism spectrum disorder-like behaviors in mice”的文章，揭示了内侧前额叶皮质（mPFC）脑区星形胶质细胞中的ATP通过P2X2受体调控小鼠的自闭症（ASD）样行为，证实了ATP在ASD的病理生理过程中发挥的潜在作用。

维真生物为本研究助力

病毒产品：AAV8-GFAP-hM3Dq-mCherry & AAV9-GfaABC1D-ATP1.0

研究背景

自闭症谱系障碍（Autism spectrum disorder,ASD）是一种较为严重的广泛性发展障碍疾病，常起病于婴幼儿期，一般有社交障碍、沟通困难、刻板行为和兴趣狭隘等症状。根据WHO发布的报告，全球每160名儿童中就有1名患自闭症。然而，截止目前ASD的发病机制仍是未解难题。

已有研究表明，在ASD患者和动物模型中观察到了星形胶质细胞的改变，但是星形胶质细胞功能障碍与ASD样表型的因果关系尚不清楚。已知星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的细胞类型，参与许多重要的脑功能，其激活主要表现为三磷酸肌醇2型受体(IP3R2)介导的细胞质钙信号的增加。先前研究表明，IP3R2基因突变与ASD相关，敲除IP3R2后星形胶质细胞出现功能障碍。然而，IP3R2缺陷引起的星形胶质细胞功能障碍是否与ASD的发生有关尚不清楚。

研究思路

首先，研究者利用IP3R2 KO（IP3R2全身敲除）和IP3R2 cKO小鼠（星形胶质细胞IP3R2特异性敲除）模型，通过双光子钙成像、多项自闭症行为测试及病毒学手段等发现IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠均表现出星形胶质细胞钙信号异常及明显的社交障碍、重复刻板等ASD样症状，这说明星形胶质细胞功能异常参与了ASD样行为。通过微透析、新型ATP探针使用及外源给药等方法发现IP3R2突变小鼠星形胶质细胞胞外ATP水平降低，而ATP给药能够改善小鼠自闭症行为，确定了星形胶质细胞ATP释放异常与ASD发生有关。最后，通过电生理、基因表达干扰等手段明确了ATP通过P2X2受体调控GABA能突触传递及ASD样行为。该研究阐述了星形胶质细胞在ASD样行为发病机制中发挥的关键作用，并确定了星形胶质细胞来源的ATP在ASD中的潜在分子角色。

部分研究结果

1、IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠均表现出ASD样行为

首先，研究者制备了IP3R2缺失的IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠模型，通过双光子显微镜成像观察发现两种小鼠体内的Ca2+信号均发生异常，说明IP3R2的表达缺失影响了Ca2+的正常释放。通过对IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠进行自闭症相关的行为学测试（三箱社交偏好实验、理毛实验及埋珠实验），研究者发现两种小鼠均表现出明显的社交障碍和重复行为，而这两种症状正是自闭症的核心表型。此外，已知mPFC脑区是ASD患者功能受损的关键脑区，在生理和病理条件下与社会行为密切相关，研究人员通过RNA干扰技术特异性敲低mPFC脑区星形胶质细胞的IP3R2，发现能够引起小鼠产生明显的社交障碍。以上结果表明，mPFC星形胶质细胞中IP3R2的缺失导致了小鼠的ASD样行为。

2、IP3R2 KO小鼠星形胶质细胞中ATP水平降低

接着，研究人员分析了mPFC中星形胶质细胞分泌的递质水平变化，以此研究IP3R2突变小鼠产生自闭症相关表型的神经生物学机制。体内微透析实验显示IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠ATP水平均显著降低，且IP3R2 KO小鼠分离的星形胶质细胞的培养液中ATP浓度也有显著降低，这说明星形胶质细胞中IP3R2的缺失造成了ATP水平的特异性降低。通过进一步研究发现细胞外ATP水平降低，总ATP及胞内ATP水平并未发生变化。作者猜测这可能是由于ATP释放减少或细胞外核苷酶降解ATP增加引起。为阐明这一假设，研究人员在mPFC星形胶质细胞中特异性表达了AAV8-GFAP::hM3Dq-mcherry和AAV9-GfaABC1D::ATP1.0（维真生物提供），前者用于星形胶质细胞的特定激活，后者用于星形胶质细胞中ATP释放的实时监测。发现与WT小鼠相比，IP3R2 KO小鼠的ATP释放明显降低，说明细胞外ATP水平的降低可能是由于ATP释放的降低。通过筛选多种细胞外ATP酶的mRNA水平及使用ATP酶抑制剂，进一步明确了胞外ATP酶活性增强也可能是胞外ATP水平降低的原因。这些数据表明，ATP释放减少和水解增加可能共同降低了IP3R2突变小鼠胞外的ATP水平。

3、ATP给药可改善IP3R2突变小鼠ASD样行为

为检验ATP降低是否与IP3R2突变小鼠的ASD表型有关，研究者对IP3R2突变小鼠进行ATP的腹腔注射。发现补充ATP后IP3R2 KO小鼠和IP3R2 cKO小鼠的社交障碍得到部分缓解，提示IP3R2突变小鼠星形胶质细胞ATP缺乏和社会损伤之间存在因果联系。为了确定mPFC中星形胶质细胞ATP的减少是否导致IP3R2突变小鼠的社会功能障碍，研究者在mPFC区注射ATPγS，得到的结果与上述结果一致，这表明mPFC脑区是IP3R2突变小鼠社交障碍的潜在位点。

4、ATP给药可恢复IP3R2突变小鼠受损的GABA能神经传递

将自闭症动物模型ASD样行为的可逆性与ASD突触理论结合，研究者猜测持续的突触病变可能是ASD的潜在原因。为验证这一假设，研究者比较了WT与IP3R2 突变鼠mPFC中神经元的电生理特性。电生理实验显示与WT组小鼠相比，IP3R2 KO和IP3R2 cKO小鼠mPFC脑区锥体神经元GABA能输入减少而谷氨酸能神经传递不受影响。而GABAAR激动剂氯硝西泮的给药明显改善了IP3R2 敲除小鼠的社交功能障碍，进一步说明GABA能传递减弱可能是IP3R2突变小鼠自闭症样表型的基础。为检测IP3R2突变小鼠GABA能传递受损是否是由星形胶质细胞ATP的减少所引起，研究者测试了ATPγS的拯救作用，发现注射ATPγS可以逆转上述现象。结合以上数据，星形胶质细胞中IP3R2缺失造成的ATP水平降低导致了GABA能突触功能障碍，可能是ASD样行为发生的基础，通过ATP治疗可使其恢复正常化。

5、mPFC脑区P2X2受体介导ATP对ASD样行为的调控

已有研究表明ATP通过P2X2R调控GABA能突触传递。研究者通过RNA干扰沉默IP3R2 cKO和对照组小鼠mPFC中的P2X2R，发现沉默P2X2R，不仅能使WT小鼠表现出明显的社交障碍，损害GABA能神经元传递，也阻断了ATP及ATPγS在治疗IP3R2 cKO小鼠自闭症和增加sIPSC频率的作用。综上所述，mPFC中的P2X2受体对于ATP的抗自闭症作用是必需的，并通过增强GABA能突触传递介导ATP对ASD样行为的调控。

结论及意义

该研究首次报道了星形胶质细胞功能障碍与ASD的发生存在直接联系：星形胶质细胞中IP3R2基因的表达缺失造成胞外ATP水平的下降，进而通过P2X2受体调控GABA能突触传递减弱，导致ASD的发生。而自闭症与抑郁症高度共病，结合该团队之前的报道-星形胶质细胞来源的ATP介导抑郁症的发生（Cao et al., Nat Med 2013），可能存在共同的病理生理机制，这一研究有望为二者的临床治疗提供有效策略。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-23843-0