【MS治疗新靶点】LRRC4在实验性自身免疫性脑脊髓炎中的神经保护作用

多发性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一种慢性神经炎性疾病，伴有脊髓脱髓鞘和神经退行性病变，多发于年轻人中。临床症状多种多样，常见的有肢体无力、感觉异常、视力下降及精神异常等，但MS的病理机制尚不完全清楚。目前，免疫系统的失调被广泛认为是MS发生和发展的因素。

近期，Molecular Medicine在线发表了题为“LRRC4 functions as a neuron-protective role in experimental autoimmune encephalomyelitis”的论文，揭示了LRRC4在实验性自身免疫性脑脊髓炎中对神经元的保护作用，为脊髓疾病机理研究提供了新的见解，并提出了治疗MS的新策略。

研究背景

富含亮氨酸重复序列4（LRRC4）是LRR蛋白家族的成员，也称作NGL-2，可以调节兴奋性突触的形成，并促进神经元的轴突分化。已有研究表明，人类LRRC4基因突变与自闭症谱系障碍（ASD）和智力残疾有关，且LRRC4可作为抑癌基因抑制胶质瘤细胞等的增殖，但是在脊髓相关疾病中LRRC4是否发挥作用尚不清楚。免疫系统的失调被广泛认为是MS的启动和发展的因素，Treg细胞在MS发病机制中发挥重要作用，调节Th细胞分化可能是MS诊断和治疗的潜在策略，本研究通过建立免疫发病机制与MS相似的EAE小鼠模型研究LRRC4对脊髓相关疾病的影响。

研究思路

首先，研究者确定了LRRC4主要在脊髓神经元中表达，并利用EAE小鼠模型检测发病过程中LRRC4在脊髓中的表达情况；然后构建LRRC4缺失（LRRC4-/-）型小鼠并对其进行EAE诱导，进行神经功能和体重评估的同时使用染色和免疫组织化学法探究脊髓的病理变化，分析LRRC4对脊髓神经元的保护作用。接着，研究者通过测定脊髓炎症相关细胞因子的表达，并利用RNA-seq分析WT与LRRC4-/-小鼠中的差异表达基因，探究了LRRC4参与EAE发病的分子机制；又通过流式细胞术检测脾脏和血液的免疫细胞因子水平以评估LRRC4缺失是否对EAE发展过程中辅助T细胞群造成影响，最后研究者使用腺相关病毒对LRRC4进行过表达（AAV-LRRC4），观察AAV-LRRC4异位表达对EAE的治疗作用。

LRRC4在EAE中发挥神经保护作用的示意图

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部分研究成果分享

1、LRRC4参与EAE的发展，并具有神经保护作用

首先，研究者使用免疫荧光染色法测定了正常小鼠的神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中LRRC4的表达，发现LRRC4主要在神经元中表达。免疫组织化学染色也证实了LRRC4在大脑皮层、海马或脊髓的神经元中表达。接着，研究者使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG35-55）诱导EAE小鼠并对脊髓中LRRC4的表达进行检测，发现EAE小鼠脊髓中LRRC4 mRNA与蛋白表达量均降低，但在大脑中未检测到差异，提示MOG35-55诱导脊髓神经元LRRC4表达下调，并参与了EAE小鼠的发病过程。

图1.LRRC4在EAE鼠脊髓中表达下调

考虑到MOG35-55是由于脱髓鞘而诱发EAE，因此研究者猜测在EAE进程中LRRC4是否在脊髓发挥神经保护作用。通过构建LRRC4缺失（LRRC4-/-）小鼠，并对其以及WT小鼠进行EAE诱导，发现LRRC4的缺失加重了脊髓的损伤程度和脊髓脱髓鞘，淋巴细胞加速向脱髓鞘病变部位募集。以上结果表明，LRRC4在EAE过程中起到保护神经元的作用。

图2.LRRC4缺失加剧EAE发展进程

2、LRRC4通过Rab7b介导NF-κB的表达，调节EAE的进程

鉴于EAE诱导的LRRC4-/-小鼠的中枢神经系统中淋巴细胞浓度较高，因此推测LRRC4-/-小鼠脊髓中促炎因子的水平要高于正常小鼠，为验证这一猜想研究者测定了各种细胞因子的水平，发现LRRC4缺失导致脊髓炎症反应升高和EAE发病机制恶化。接着研究者剖析了潜在的分子机制，检测了在炎症和EAE发病机制中作用已得到证实的NF-κB、ERK/MAPK和PI3K/AKT信号通路相关因子NF-κB, p-AKT和p-ERK1/2在正常和EAE状态下LRRC4-/-小鼠和WT小鼠中脊髓中的水平，发现LRRC4缺失诱导NF-κB的上调和脊髓炎症相关细胞因子水平的改变，提示这可能是EAE加速发展的原因之一。

图3.LRRC4缺失上调EAE小鼠NF-κB的表达

为进一步探究LRRC4参与EAE发病的分子机制，研究者应用RNA-seq来阐明LRRC4缺失后小鼠脊髓的转录基因变化并进行差异表达基因（DEG）的分析。发现上调的DEGS的KEGG通路与肌萎缩侧索硬化症有关，其中小G蛋白Rab7b上调非常明显，且它已被证实可以激活NF-κB并能促进IL-6的产生。通过检测Rab7b的表达，研究者发现LRRC4-/-小鼠中Rab7b的mRNA和蛋白质水平均高于WT小鼠，且EAE小鼠脊髓中Rab7b mRNA表达增强，且与LRRC4呈负相关，这增加了Rab7b参与EAE发病的可能性。

图4.RNA-seq分析揭示Rab7b在EAE中的作用

为确定LRRC4、Rab7b与NF-κB之间的联系，研究者在分离的LRRC4+/+和LRRC4−/−小鼠的神经元中检测了Rab7b和NF-κB p65的表达，发现两者在LRRC4−/−小鼠神经元中表达上调，且外源表达LRRC4后两者水平均降低。通过RNAi干扰Rab7b后，在LRRC4+/+小鼠神经元中表现为NF-κB p65表达量下降，LRRC4−/−小鼠中未见下降，而当Rab7b与LRRC4共转染时，NF-κB p65表达显著降低。这说明，Rab7b能在LRRC4存在的情况下调节NF-κB，提示Rab7b可能是LRRC4在NF-κB调控中的下游效应因子。

图5.Rab7b介导LRRC4−/−神经元NF-κB上调

3、LRRC4缺失导致更严重的Th1免疫反应

研究者先前研究已证明，在胶质母细胞瘤细胞中LRRC4可导致NF-κB活化，并产生IL-6、CCL2和IFN-γ。而IL-6诱导T细胞分化成Teff细胞，而非Treg细胞。EAE小鼠伴有强烈的髓鞘特异性自身免疫反应，而LRRC4的缺失导致更严重的髓鞘变性，因此推测LRRC4−/−可能引起更严重的免疫反应。为此研究者对LRRC4缺失是否会导致EAE发展过程中辅助T细胞群体的改变进行了探究。使用流式细胞仪测定免疫15 d后小鼠的脾脏和血液中细胞因子的比例，发现LRRC4缺失未改变正常小鼠脾脏和血液Th1细胞的比例，但却增加了EAE小鼠中Th1细胞的比例。进一步对Treg细胞分析发现，LRRC4−/−的EAE小鼠脾脏中的Treg细胞明显减少，这说明，LRRC4缺失导致了Th1免疫反应，免疫调节功能减弱，这可能加速了EAE的进程。

图6.LRRC4缺失导致更严重的Th1免疫反应

4、过表达LRRC4减轻EAE进展

在证明了LRRC4在EAE小鼠中表达下调，并且LRRC4缺失会加剧EAE进程后，研究者猜测异位表达LRRC4是否可以修复EAE的病理缺陷。因此，使用腺相关病毒（AAV-LRRC4）对小鼠进行过表达LRRC4处理，注射10 d后用MOG35-55诱导EAE并进行临床评分以及组织染色研究。结果表明LRRC4的过表达减缓了EAE的进程，同时也减轻了EAE引起的脱髓鞘和自身免疫缺陷。因此，研究者提出AAV-LRRC4病毒可能被用作治疗MS患者的治疗工具，为MS疾病的治疗提供新的方法。

图7.过表达LRRC4减轻EAE发展进程

结论意义