Molecular Cell｜北大刘涛教授课题组开发cCas12a平台，大大提高Cas12a系统基因编辑效率！

近期，北京大学刘涛教授课题组在Molecular Cell （IF=17.970）上发表了题为“Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates”的研究论文，文章报道了利用生物正交化学方法，将位点特异性修饰的Cas12a蛋白和5’端化学修饰的crRNA生成共价Cas12a-crRNA复合物（cCas12a），不仅提高了Cas12a系统在哺乳动物细胞中的基因组编辑效率，还能够用于CAR-T细胞制备中的精确基因敲入和多重基因编辑。本研究为Cas12a系统的广泛应用奠定了基础，同时也为改造其它低效的Cas家族成员提供了潜在思路。

01 研究背景

02 设计思路

针对Cas12a和crRNA的弱结合力问题，研究人员提出了Cas12a与crRNA共价交联的策略，通过基因密码子扩展技术在Cas12a核酸酶上定点引入了含有叠氮基团的非天然氨基酸，结合蛋白晶体结构分析，得到位点特异性修饰的Cas12a蛋白，并与5’端DBCO（二苯并环辛炔）修饰的crRNA共价偶联，生成了有活性的核糖核蛋白复合物（RNP）。此策略将Cas12a和crRNA共价连接成一个组分，RNP复合物可以直接传递到细胞中，在到达目标位点之前共价键还可以防止复合物解离，安全性及准确性均较高。

Cas12a-crRNA复合物的开发

03 研究结果分享

1.cCas12a的设计与生成

研究表明，Cas12a crRNA的5’端经修饰后活性不会受影响，由此研究人员尝试将crRNA的5’端与Cas12a共价结合。首先确定了合适的交联位点为AsCas12a（来自氨基酸球菌属）蛋白的第806位甲硫氨酸（M806）,并通过非典型氨基酸诱变技术将其替换为含叠氮基团的非天然氨基酸AeF，生成了突变体AzCas12a。经体外DNA切割等实验检测证实AzCas12a与WT Cas12a具有相同的的核酸酶活性。随后，研究人员将5’DBCO修饰的crRNA通过叠氮-炔环加成反应共价连接到AzCas12a，生成了cCas12a RNP复合物。体外DNA切割试验证实了cCas12a RNP复合物的核酸酶活性。

图1. 位点特异性叠氮基修饰Cas12a的生成及与5’端修饰crRNA的共价结合

2.CRISPR/cCas12a在哺乳动物细胞中的基因编辑效率大大提高

cCas12a RNP复合物生成后，研究人员对其切割效率进行了验证：在HEK293-EGFP- Teton细胞中，cCas12a RNP对EGFP基因的编辑效率约是WT Cas12a和非共轭AzCas12a的3倍，而对HEK293细胞中5个内源性基因位点的编辑效率提高了1.6-18.3倍；在3种难转染细胞（K562、Jurkat和NIH/3T3）中,cCas12a RNP对相关基因的编辑效率也大大提高（2~4倍）。这说明，Cas12a与crRNA共价交联可以大幅提高不同细胞中不同位点的基因编辑效率。

图2. CRISPR/cCas12a在哺乳动物细胞中的基因编辑效率大大提高

3.CRISPR/cCas12a脱靶效应的评估

接下来，研究人员对CRISPR/cCas12a的脱靶效率进行了评估。首先，使用GUIDE-seq方法评估了cCas12a和WT Cas12a RNPs对HEK293细胞中三个不同基因位点（hHPRT1、GUK1和DNMT1）的靶效率和脱靶效率。结果表明，cCas12a对3个基因的打靶率增加了2-6倍。此外，cCas12a对hHPRT1和GUK1基因的脱靶切割未检测到。对于本身脱靶率极高的DNMT1基因，研究人员也确实检测到了cCas12a对DNMT1的非靶向切割。这些数据表明，cCas12a RNP复合物可以大幅提高基因的靶上编辑效率，而脱靶效应的风险可能取决于crRNA的内在序列特异性。

图3. CRISPR/cCas12a脱靶效应的评估

4.共价交联策略在Cas12a家族的扩展应用

除了可将AsCas12a与crRNA共价交联外，研究人员还将此共价交联策略成功应用于其它Cas12a家族蛋白——LbCas12a（来自毛螺菌科细菌），同样地，选择了合适的交联位点H759，将其突变为H759AeF，并与修饰的crRNA共价交联，生成LbCas12a RNP复合物。体外实验检测发现LbCas12a RNP对基因的切割效率为WT LbCas12a的1.7倍，证实了共价交联策略也可用于其他Cas12a家族成员。此外，研究人员进一步探索发现此共价交联策略还可应用于其它现有的Cas12a突变体及基于Cas12a的碱基编辑器（见原文补充结果3）。

5.CRISPR/cCas12a提高了HDR介导的精确基因敲入效率

已知Cas12a的切割位点远离其识别位点，在插入/缺失形成后的目标位点上提供额外的切割机会，增加了HDR介导的基因整合机会。因此作者探究了cCas12a RNP是否也能提高HDR效率，将cCas12a RNP和靶向hHPRT1基因的带有EcoRI识别位点的单链供体DNA电转入HEK293细胞。检测发现，cCas12a RNPs的HDR效率是WT Cas12a的7-8倍，证实了CRISPR/cCas12a可以提高哺乳动物细胞中基于Cas12a的HDR效率。

图4. CRISPR/cCas12a提高了HDR介导的精确基因敲入效率

6.cCas12a 提高了位点特异性整合的CAR-T细胞制备效率

CAR-T细胞免疫疗法是目前极具前景的肿瘤治疗方式之一，基因编辑技术的应用有望改善当前和发展中的CAR-T细胞免疫治疗策略。研究报道，Cas12a结合AAV载体递送策略制备的CAR-T细胞效率更高。那么，cCas12a平台是否可以用于CAR-T细胞的制备呢？对此研究人员进行了探究。将WT Cas12a和cCas12a RNP电击导入人原代T细胞，对内源性TRAC基因进行定点敲除，随后用 AAV6-CD19 CAR（维真生物包装助力）感染T细胞，使CAR基因定点重组至TRAC基因座中。流式检测CAR敲入效率，结果显示cCas12a对CAR的敲入效率是WT Cas12a的近2倍。对WT Cas12a和cCas12a制备的CAR阳性细胞免疫学特性分析显示，cCas12a制备的CAR-T细胞免疫特性与WT Cas12a相同。上述结果表明，cCas12a系统提高了CAR-T细胞的制备效率，并且T细胞经cCas12a处理后的免疫特性与WT Cas12a系统相同，表明cCas12a系统在T细胞工程中具有潜在的应用价值。

图5. 利用cCas12a在人原代T细胞中进行CAR整合

7.利用cCas12进行高效的多重基因组编辑制备通用CAR-T细胞

目前临床上多使用自体T细胞进行CAR-T细胞免疫治疗，但受自体T细胞质量、数量及时间和成本等因素的限制，基于CRISPR系统制备通用CAR-T细胞可以避免这些限制。研究人员利用cCas12a进行了T细胞中多重基因编辑，同时敲除了内源性TRAC, β-2微球蛋白 (β2M), PD1与CTLA4基因，同时在TRAC位点定点敲入了CAR基因，制备了通用型CAR-T细胞。多重基因敲除效果检测显示无论是同时敲除双基因、三基因还是四基因，与WT Cas12a系统相比，cCas12a系统的多基因编辑效率均更高，证实cCas12a可以进行高效地多重基因组编辑，用于制备通用CAR-T细胞。

图6. 利用cCas12a介导的多基因编辑高效生成通用CAR-T细胞

04 小结

综上所述，研究人员利用共价交联策略生成的Cas12a蛋白与crRNA的复合物cCas12a不仅大幅提高了哺乳动物细胞中基于Cas12a的基因组编辑效率，并且可以应用于CAR-T细胞制备的精确基因整合和多重基因编辑，为高效的哺乳动物细胞工程提供了有用的工具，有望推动新一代更安全可控的免疫细胞制备。