Bioactive Materials ‖湖南大学胡小晓团队揭示核酸适体S11e特异性识别纤维肉瘤并抑制肿瘤生长的机制

研究背景

研究思路

在本研究中，作者发现核酸适体S11e能够识别纤维肉瘤细胞(HT1080)，并且S11e能在HT1080异种移植小鼠模型和纤维肉瘤患者的肿瘤组织中识别肿瘤。此外，作者还证实了S11e不依赖于溶酶体途径而内化到HT1080细胞中，并位于线粒体中。不仅如此，还发现S11e促进了HT1080细胞的凋亡，并抑制了HT1080细胞的迁移。最后，作者利用质谱方法研究了S11e的生物功能细胞靶点，发现Diablo/ SMAC蛋白是S11e的细胞结合蛋白，通过与S11e相互作用抑制HT1080细胞的迁移和侵袭。综上所述，这些结果表明S11e可能有助于纤维肉瘤的早期诊断、靶向治疗和预后。

部分研究成果分享

1. S11e在HT1080细胞中的细胞器共定位

首先，作者利用流式细胞术检测HT1080与已有的具有已知序列的核酸适体的结合能力，成功的鉴定到与HT1080有高亲和力的S11e。接着，分析探讨了S11e在HT1080细胞中的细胞器共定位，发现溶酶体追踪器和cy5标记的S11e的荧光信号没有重叠，线粒体荧光探针Mito-tracker和cy5标记的S11e荧光信号在4℃完全重叠，表明S11e可以定位于HT1080细胞的线粒体。此外，S11e可以在不被溶酶体内化的情况下成功逃逸到线粒体中，使S11e成为一种极好的潜在载体，可以保护自己免受溶酶体中各种消化酶的降解。

图1.HT1080细胞与Cy5-S11e(红色)和Mito-tracker及Lyso-track(绿色)的共定位

2. S11e特异性识别肿瘤组织

核酸适体识别体内肿瘤的能力是评价能否应用于临床的重要指标。为此作者将修饰后的核酸适体通过尾静脉注射小鼠，发现注射后5min，S11e在肿瘤部位的荧光信号增强，而Library在肿瘤部位未见明显荧光信号，说明S11e在肿瘤部位聚集。通过观察Cy5标记的S11e在小鼠体内的生物学分布，发现S11e在体内具有靶向纤维肉瘤的能力。

图2. S11e在HT1080异种移植小鼠模型中的荧光成像

作者进一步通过将Cy5和Cy5标记S11e与纤维组织病理切片共同孵育，发现正常组织中未见红色Cy5荧光信号，良性肿瘤组织中可见轻微红色荧光信号，恶性肿瘤组织中可见强红色荧光信号，表明S11e在体外可以识别纤维肉瘤组织。

图3.S11e识别患者组织样本中的肿瘤细胞

3. S11e促进纤维肉瘤细胞凋亡并引起相关蛋白表达的改变

为研究S11e的生物学功能，作者进行了细胞毒性实验。分别用S11e和Library（随机文库）处理HT1080细胞后，细胞活力分别为49.08%和93.42%，说明S11e而不是Library对HT1080细胞具有细胞毒性作用。综上所述，S11e可有效诱导HT1080细胞凋亡，提示S11e对肿瘤细胞具有潜在的治疗作用。

图4. S11e或Library对HT1080和MRC-5细胞毒性分析

接下来，作者利用Western blotting实验对S11e诱导HT1080细胞凋亡的途径进行了进一步探究。发现HT1080细胞与S11e孵育后，cleaved- caspase -9 (37 kDa)、cleaved- caspase -3 (17 kDa)和cleaved- PARP (89 kDa)的表达增加。当Caspase-9被激活时，Caspase-3被激活，Caspase-3进一步切割凋亡的关键酶PARP，直接诱导凋亡。这些结果表明，S11e特异性地通过线粒体介导的内源性凋亡途径诱导细胞凋亡。

图5. S11e或Library 处理后，HT1080细胞中凋亡蛋白的表达

4. Diablo/SMAC是S11e结合的功能性细胞蛋白

接下来，作者探究了与S11e结合的功能性细胞蛋白。有趣的是，在S11e处理的细胞中特异检测到分子量为85 kDa和20 kDa的两条蛋白带，而在Library处理的细胞中检测不到。通过重点筛选分子量在15-25 kDa至70-90 kDa之间的蛋白，然后用S11e与Library的评分比对其进行排序，发现Diablo/SMAC (21 kDa)在凋亡触发后可以从线粒体膜间隙释放到细胞溶胶，与其他攻击相比排名较高。因此，作者推测Diablo/SMAC是S11e的潜在结合靶点。

图6.S11e结合蛋白质谱分析

为证实上述推测，作者使用三条独立的Diablo/SMAC特异性shRNA进行了功能缺失分析，其中shSMAC 1和shSMAC 2对Diablo/SMAC干扰效果更加显著。

图7.Diablo/SMAC shRNA敲除效果

作者还对经S11e处理的Diablo/SMAC沉默的HT1080细胞进行了细胞划痕和侵袭实验。结果表明，SMAC的表达降低后，S11e对HT1080细胞迁移和侵袭的抑制作用被消除，上述结果证实，SMAC是纤维肉瘤细胞中S11e的功能性结合靶点。

图8.Diablo/SMAC为S11e的功能结合蛋白

小结

综上所述，本研究发现核酸适体S11e可以特异性识别纤维肉瘤细胞，并且S11e能在HT1080异种移植小鼠模型和纤维肉瘤患者的肿瘤组织中识别肿瘤组织；同时发现S11e可以促进HT1080细胞的凋亡并抑制了HT1080细胞的迁移。此外，确定了Diablo/ SMAC蛋白是S11e的细胞结合蛋白，通过与S11e相互作用抑制HT1080细胞的迁移和侵袭。

本研究为S11e作为纤维肉瘤的早期诊断、靶向治疗和预后的有效工具提供了新的见解。