2016年，科学家发现了可以靶向RNA进行切割的CRISPR/Cas13系统，该系统由单一的效应蛋白Cas13和CRISPR RNA（crRNA）组装形成一个由crRNA引导的RNA靶向效应复合物。目前，Cas13家族共鉴定出四种亚型，包括Cas13a（又名C2c2）、Cas13b、Cas13c和Cas13d，四种Cas13亚型蛋白分子量均小于Cas9蛋白。所有Cas13蛋白均具有两种不同的催化活性：①由两个较高等的真核和原核核苷酸结合（Higher eukaryotes and prokaryotes nuceotide-binding，HEPN）结构域提供的RNase活性，这是靶RNA降解所必需的。Cas13 四个亚型同源性较低，且同源序列仅限于HEPN结构域位点，此外两个HEPN结构域中的单点突变会使CRISPR/Cas13系统对RNA的切割能力完全丧失；②催化pre-crRNA加工和形成成熟crRNA的RNase活性。

图1. VI CRISPR/Cas系统结构示意图

与CRISPR II类系统的其它核酸酶结构一致，Cas13a的整体结构是双叶的，N-末端结构域（N-terminal domain，NTD）和Helical-1结构域构成crRNA识别叶（REC lobe），HEPN1、Helical-2、HEPN2结构域形成核酸酶叶（NUC lobe）（图2）。CRISPR/Cas13b系统有两种酶，分别是VI-B1和VI-B2，它们之间的区别在于Cas13b转座子上携带的附属蛋白的基因型不同，VI-B1的附属蛋白是Csx28，而VI-B2的附属蛋白是Csx27。绝大多数Cas13d型系统还含有包含 WYL结构域的相关辅助蛋白，WYL结构域通常与原核防御系统有关（图1）。

图2. Cas13a蛋白结构域示意图

所有的Cas13蛋白酶都需要60- 66 nt的crRNA来确保靶向特异性。四种亚型crRNA都有一个促进与相应Cas13蛋白酶结合的直接重复（Direct repeat，DR）以及特异性靶向转录本的间隔序列。Cas13b的crRNA在3’端携带直接重复，而Cas13a、c和d的crRNA在5’端携带直接重复（图3）。

图3. 四种Cas13亚型对应的crRNAs结构示意图

CRISPR/Cas13系统的防御机制主要包括以下几个阶段（以Cas13a为例）：①pre-crRNA 的识别与结合。新转录的pre-crRNA通过crRNA的5’端茎环结构与Cas13a的REC叶识别并结合，形成pre-crRNA与Cas13a复合物的中间过渡态；②成熟crRNA的形成。NUC区的Helical-1和HEPN2结构域之间保守残基的构象发生变化，从而形成一个酸碱催化中心，催化酶切pre-crRNA形成成熟的crRNA。此时的crRNA-Cas13a复合物处于无酶切活性状态；③crRNA-Cas13复合物酶切活性的激活。靶ssRNA进入crRNA-Cas13a复合物内与crRNA发生碱基互补配对，诱发Cas13a发生构象变化，从而激活crRNA-Cas13a复合物的酶切活性；④靶RNA的降解。在crRNA的引导下，Cas13a的HEPN结构域催化靶ssRNA的酶切。

有时细菌细胞中会出现非特异性酶切的情况，导致细胞中其他附属ssRNA的降解，引起一定的细胞毒性，但这种现象在哺乳动物细胞中并未出现，其原因目前尚未可知。（图4）。

图4. CRISPR/Cas13系统作用机制示意图

2018年，加州大学伯克利分校Patrick D. Hsu实验室发现了靶向RNA的Cas13d家族，Cas13d平均大小为930 aa，是目前发现的哺乳动物细胞中相对较小的Ⅱ类CRISPR效应因子（比其家族成员Cas13a-c小20%，比Cas9小33%），使它更容易包装到容量有限的应用载体如AAV载体中。此外，Cas13d对RNA靶点的切割不依赖于PFS序列（protospacer flanking sequence，相当于Cas9针对DNA的PAM序列），这极大的增加了Cas13d的应用范围，使其成为进一步开发靶向RNA工具的潜在平台。与RNA干扰技术相比，Cas13d介导的基因沉默具有更高的特异性（与数百个shRNA脱靶相比，Cas13d没有脱靶）和敲除效率（Cas13d达到96％，shRNA达到65％， CRISPRi达到53％）。而与Cas9介导的基因敲除技术相比，Cas13d介导的基因沉默不会改变基因组DNA，因此这种基因沉默是可逆的，对一些后天性疾病的治疗更有优势（图5，图6）。

图5. 一种引导和靶向激活Cas13d核糖核酸酶活性的模型

图6. Cas13d系统具有更高的特异性和敲除效率

与此同时，Patrick D. Hsu实验室又鉴定出一种效果更佳的Cas13d酶：即来自肠道细菌黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）XPD3002，被命名为CasRx。随后，科学家通过多项实验证明了CasRx能在体内外可高效敲除RNA。同时，CasRx蛋白由于体积小，编辑效率高，被认为是在未来中极具应用优势的Cas13蛋白。

2020年的一项研究探索了使用CasRx系统来定向沉默基因的可行性。首先，研究者选择Pten作为代谢调控基因，研究CasRx是否能以代谢基因为靶点进行有效的基因敲除，并制备了多个针对Pten mRNA编码序列的sgRNAs，研究者将CasRx和每个Pten sgRNA通过质粒转导至小鼠神经母细胞瘤N2a细胞中，并进行sgRNA的体外筛选，找到了CasRx敲低目的基因的最佳sgRNA组合：sgPten-5和sgPten-6。结果显示，在转染CasRx、sgPten-5和sgPten-6的N2a细胞中，Pten的表达水平显著降低，AKT的磷酸化水平显著升高，此外与shRNA系统相比，CasRx编辑系统表现出来更强的特异性和更低的脱靶率（图7）。（延伸理解：Pten被认为是一种代谢调节剂，通过抑制PI3K/AKT途径抑制胰岛素信号转导通路，Pten的缺失能促进AKT的磷酸化）

图7. CasRx体外介导Pten的敲除

研究人员通过尾静脉注射敲低Pcsk9的AAV8病毒，显著降低了肝脏和血清中Pcsk9的表达量以及血清中的胆固醇水平。重要的是，CasRx介导的Pcsk9敲低是可逆的，Pcsk9表达水平可以反复下调。CRISPR/CasRx系统为可逆调节代谢基因，尤其是一些后天性疾病（如因不良生活习惯导致的高血脂等后天代谢性疾病等）提供了一种有效的策略（图8）。

图8. CasRx介导的血清胆固醇降低和PCSK9可逆调节

维真科研团队针对mcherry基因设计了多条gRNAs，并选择了其中两条敲除效果好的gRNAs（gRNA1和gRNA2），进行了单条gRNA、2in1 gRNAs敲除效果的验证试验，结果如下：

从上述荧光图可看出，2in1 gRNAs敲除组，mCherry表达水平大大降低，敲除效果明显好于单条gRNA的敲除效果。

（mcherry表达量：gRNA1组 0.38；gRNA2组 0.47；gRNA1+2组 0.18）

此外，从上图mCherry mRNA表达量的检测实验结果可以看出，Cas13d(CasRx)-gRNA系统可以特异高效地降低靶向基因的表达（mCherry），并且2in1gRNAs 能实现mRNA水平敲低82%。

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