《Cell》‖ 浙江大学靳津和东南大学柴人杰研究团队联合发文:应激反应致外周CD4+ T细胞代谢紊乱诱发焦虑行为

应激反应是各种紧张性刺激物引起的个体非特异性反应，包括生理反应和心理反应两大类。生理反应表现为交感神经兴奋、垂体和肾上腺皮质激素分泌增多、血糖升高、血压上升、心率加快等；心理反应包括情绪反应与自我防御反应等。研究发现应激反应会引起外周T淋巴细胞功能紊乱，脑神经可塑性的变化，增加抑郁和焦虑的风险。T淋巴细胞在情感障碍疾患中的调节机制和病理性作用是怎样的呢？浙江大学靳津和东南大学柴人杰研究团队使用维真生物AAV-shRNA产品在《Cell》（IF=38.637）杂志联合发表“Stress-Induced Metabolic Disorder in Peripheral CD4+T Cells Leads to Anxiety-like Behavior”的研究论文，文章揭示了CD4+ T细胞嘌呤代谢紊乱与应激诱导的焦虑行为之间的关联。

研究结果

1. CD4+ T细胞在应激诱导的焦虑行为中起重要的作用

作者通过足部电击 (electronic foot shock，ES)野生型（WT）和Rag1-/- （免疫缺陷）小鼠诱发焦虑模型，开场试验（Open Field Test，OFT）发现，Rag1-/-小鼠对中心区域探索和运动的兴趣没有降低，与研究报道急性ES小鼠的外周血管CD4+和CD8+淋巴细胞数量明显增加结果一致，表明焦虑发生的起始阶段免疫系统会适应性的改变。

通过静脉注射中和抗体来耗尽CD4+和CD8+细胞，作者发现只有CD4+ T细胞的去除显著逆转了OFT和高架十字迷宫实验（elevated plus-maze test，EPM）ES诱导的焦虑行为。CD4+ T细胞缺乏可以阻止急性束缚应激（acute restraint stress，RS）引起小鼠产生焦虑。上述结果表明CD4+ T细胞对物理应激诱发的焦虑行为有着广泛的影响。

为评价T细胞是否具有焦虑印迹保留作用，将NT小鼠和ES小鼠脾脏CD4+或CD8+ T细胞分别过继转移到Rag1-/- 小鼠，发现只有接受ES诱导的CD4+T细胞的Rag1-/-小鼠在OFT中产生焦虑行为，且初始CD4+ T细胞引发的焦虑程度要比效应T细胞更严重。（实验结果如图1）

图1  CD4+ T细胞在应激诱导的焦虑行为中起重要作用

2. 应激诱导外周血CD4+T细胞线粒体分裂

测序分析ES小鼠的CD4+和CD8+ T细胞RNA转录组，CD4+ T细胞中鉴定出128个特异性差异表达基因(DEGs)，基因本体分析显示大多数DEGs编码线粒体蛋白质。胞外酸化速率（extracellular acidification rate, ECAR）和耗氧速率（axygen consumption rate, OCR）测定显示，ES和RS小鼠初始CD4+ T细胞的糖酵解和氧化磷酸化水平均显著下降，线粒体的结构和功能受到影响。通过共聚焦显微成像和免疫印迹技术检测，发现ES初始CD4+ T细胞的线粒体呈点状，线粒体融合的外膜蛋白MFN2和MIGA2显著减少，表明CD4+ T细胞在应激状态下表现为线粒体形态异常和代谢功能障碍。

研究发现白三烯B4（LTB4）给药会使小鼠产生严重的焦虑行为，去除CD4+ T细胞后焦虑行为消失。体外实验显示在应激反应中LTB4显著增加线粒体分裂，降低了MFN2和MIGA2在初始CD4 + T细胞中的表达。研究证明应激反应可诱导LTB4启动外周血CD4+ T细胞线粒体的裂变，并引发焦虑。（实验结果如图2）

图2  应激导致CD4+ T细胞代谢紊乱和线粒体裂变

为了确定T细胞线粒体形态与焦虑行为的关系，作者建立了Miga2-/-小鼠，OFT、EPM、暗-光转换和悬尾实验中，Miga2-/-小鼠表现出严重的抑郁症状，并在初始CD4+ T中观察到了高度破碎的线粒体。为了进一步阐明外周血CD4+ T细胞线粒体分裂的特殊功能，作者生成了Miga2 T细胞条件敲除(KO) (Miga2TKO)小鼠。缺乏Miga2的T细胞在T淋巴细胞的发育和稳态方面没有表现出任何明显的异常，但Miga2TKO小鼠仍然表现出类似于Miga2-/-小鼠的焦虑样行为。Miga2TKO小鼠在连续EPM测试中表现出正常的恐惧记忆消失，说明Miga2缺陷的CD4+ T细胞对正常的学习记忆没有影响。为了消除Miga蛋白在焦虑中的特殊功能，作者又生成了Mfn1和Mfn2 T细胞条件下双KO (Mfn1/ 2TKO)小鼠，T细胞中缺乏Mfn1/2的小鼠与野生型小鼠相比也表现出类似焦虑的行为，这表明焦虑行为是由线粒体形态紊乱引起的，而不是由某些线粒体蛋白的特定功能引起的。（实验结果如图3）

图3  CD4+ T细胞线粒体的持续分裂导致产生焦虑行为

3. T细胞线粒体的持续裂变导致全身嘌呤代谢紊乱

聚类分析显示Miga2TKO小鼠的代谢组学特征与同窝WT小鼠有显著差异，代谢产物的差异主要集中于嘌呤代谢。Miga2TKO小鼠体内嘌呤及其衍生物（腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤）的含量是同窝野生型小鼠的10-100倍。去除CD4+ T细胞后，Miga2TKO小鼠血清黄嘌呤浓度显著降低。在两种啮齿动物焦虑模型和过继性转移ES小鼠CD4+ T细胞的Rag1-/-小鼠血清中也观察到黄嘌呤浓度明细增加。

WT小鼠体内注射合成的黄嘌呤或腺苷发现，黄嘌呤、腺嘌呤和单磷酸阿糖腺苷都能引发小鼠产生焦虑行为。BCX-1777（嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂）明显降低Miga2TKO和ES小鼠的焦虑症状，同时显著降低小鼠血清黄嘌呤的浓度。由此可知，病理性CD4+ T细胞引起的黄嘌呤过量在焦虑行为中起至关重要的作用。（实验结果如图4）

图4  CD4+ T细胞线粒体的分裂导致血清嘌呤增加

4. 黄嘌呤直接作用于小鼠左侧杏仁核的少突胶质细胞

研究表明杏仁核在恐惧和持续焦虑的产生起关键作用，左杏仁核与社交焦虑、强迫症、创伤后应激以及焦虑有关。组织学分析发现，Miga2TKO小鼠左杏仁核比右杏仁核和WT小鼠杏仁核更大，非神经元细胞的数量更多。经黄嘌呤处理的小鼠左杏仁核表现出与Miga2TKO小鼠相似的病理表型。单细胞RNA测序显示，腺嘌呤和黄嘌呤发挥通过A1、A2A、A2B和A3四种受体亚型发挥各自的生理功能，且A1在少突胶质细胞中大量表达。

作者分析了 WT、Miga2-/-、αCD4处理的Miga2-/-小鼠杏仁核中非神经元细胞的转录组。scRNA 序列和FACS分析显示Miga2-/-小鼠少突胶质细胞比例显著增加，去除CD4+ T细胞可逆转此现象。BRdU掺入试验发现，黄嘌呤作为致病因素，可显著增加少突胶质细胞的DNA合成和细胞周期，直接诱发少突胶质细胞的增殖。已有资料表明黄嘌呤作用于A1受体并促进蛋白激酶A (PKA)/ cAMP的活性。作者发现Miga2-/-小鼠少突胶质细胞中PKA/ cAMP通路被明显激活，耗尽CD4+T细胞可下调该通路。作为左侧杏仁核少突胶质细胞唯一可检测到的腺苷受体A1，通过注射腺相关病毒AAV-MBP-shAdor1-GFP（维真生物提供）成功地特异性敲低A1受体，Miga2-/-小鼠不再表现出焦虑症状。（实验结果如图5）

图5  CD4+ T细胞来源的黄嘌呤通过A1受体作用于左杏仁核的少突胶质细胞

5. 线粒体裂变促进CD4+ T细胞中黄嘌呤的合成

嘌呤有两种合成途径：从头合成和回收。在从头合成途径中，葡萄糖代谢产物5-磷酸糖苷基-1-焦磷酸(PRPP)提供了形成嘌呤环的骨架结构。研究发现Miga2-/-和Mfn1/2TKO小鼠CD4+ T细胞氧化磷酸化和糖酵解活性显著降低，但5-磷酸核糖（R-5-P）、CAIR、腺苷和肌苷则大量增加，表明线粒体在从融合到裂变过程中，葡萄糖通过磷酸戊糖途径（PPP）重新合成嘌呤。2-脱氧-D-葡萄糖（抑制糖酵解、PPP和嘌呤的合成）可使Miga2TKO小鼠的焦虑症状和左杏仁核病理特征恢复正常。

WT和Miga2-/-小鼠初始CD4+ T细胞的转录组分析表明，Miga2-/-小鼠的 CD4 + T细胞与糖酵解和脂肪酸ß氧化途径相关的多个关键酶转录水平显著降低，但是嘌呤合成所需的分子：己糖激酶3 (Hk3)、腺苷脱氨酶(Ada)、嘌呤核苷磷酸化酶2 (Pnp2)和黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤脱氢酶(Xdh)有所增加。PNP催化肌苷和鸟苷转化为次黄嘌呤或鸟嘌呤。与PNP相似，PNP2也是一种调节嘌呤代谢途径和黄嘌呤产生的酶，由于其在初始CD4+ T细胞中的低表达，认为其缺乏可能不会像PNP缺乏那样导致严重的免疫缺陷。Pnp2-/-小鼠未表现出任何明显的T淋巴细胞发育或成熟障碍，进一步与Miga2-/-小鼠杂交产生Pnp2-/-/Miga2-/-小鼠，当Pnp2-/-/Miga2-/-CD4+ T细胞过继转入Rag1-/-小鼠后，Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T细胞不像Miga2-/- CD4+ T细胞那样引起焦虑症状。由于Pnp2缺失不能完全阻断黄嘌呤的合成，在移植Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T细胞的Rag1-/- 小鼠血清中，黄嘌呤仍有适度升高。这些结果表明CD4+ T细胞来源的过量黄嘌呤可直接导致焦虑行为。（实验结果如图6）

图6  CD4+ T细胞线粒体的裂变促进嘌呤从头合成途径

干扰素调节因子-1（IRF-1）作为一种转录因子，参与细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节等多种细胞过程。作者发现Miga2-/-和ES小鼠CD4+T细胞中IRF-1显著积累。染色质免疫共沉淀技术研究表明巨噬细胞IRF-1富集于Ada、Xdh和Pnp2的启动子区域。IRF-1缺乏使Miga2-/-小鼠CD4+ T细胞Ada和Xdh mRNA和蛋白水平恢复正常化，减轻了Miga2TKO小鼠的焦虑行为。CD4+ T细胞中的IRF-1在线粒体裂变调节嘌呤合成并产生焦虑症状中起着至关重要的作用。（实验结果如图7）

图7  IRF-1的积累促进嘌呤合成和焦虑行为

结论

本研究揭示了外周血CD4+ T细胞来源的黄嘌呤和焦虑行为之间的重要联系。如下：

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