Genes & Diseases (IF 14.6)｜重医儿童医院田杰/潘博团队联合复旦中山医院路福建团队揭示限制性心肌病治疗新靶点！

限制性心肌病(RCM)是一种罕见的致命性疾病，在儿童中病情进展迅速。TNNI3基因编码心肌肌钙蛋白I(cTnI)，其基因突变是遗传性RCM的常见原因。尽管cTnI突变会增加肌丝钙敏感性并损害舒张功能，但仅靠这种机制并不能完全解释疾病的发病机制。免疫系统在心血管疾病中发挥着重要作用，但其参与RCM的情况仍不清楚。近期重庆医科大学附属儿童医院田杰、潘博团队联合复旦大学附属中山医院路福建教授团队在Genes & Diseases (IF 14.6)上发表文章“Activation of the cGAS–STING pathway mediated by IRGM1 contributes to the development of restrictive cardiomyopathy induced by cTnIR193H mutation”，研究首次揭示了免疫机制在RCM发病机制中发挥着至关重要的作用，并从免疫学角度为RCM治疗提供了潜在的靶点。

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WB和免疫荧光结果证明AAV成功介导基因过表达

研究结果

1. cTnIR193H和IRGM1之间的体外和体内相互作用增强

作者构建了cTnIR193H点突变小鼠模型，RNA测序分析表明cTnIR193H诱导的RCM小鼠中免疫途径上调。为在活体心肌内捕获cTnI及其突变体的瞬时、稳定互作蛋白，研究构建携带AirID标签的野生型Tnni3与突变Tnni3^R193H融合基因，包装为心肌特异性AAV9病毒并注射新生小鼠实现心脏特异性过表达，依托 AAV9介导的体内生物素邻近标记联合定量质谱分析，筛选得到野生型cTnI与突变体cTnIR193H的差异互作蛋白，锁定IRGM1为核心差异免疫相关分子。免疫共沉淀和酵母双杂交实验证实cTnI和cTnIR193H均与STAT1相互作用，且相互作用水平无显著差异，但与cTnI相比，cTnIR193H与IRGM1的相互作用更强。体内互作实验再次验证了这一结果，并表明IRGM1与cTnI或cTnIR193H具有明显的共定位模式。此外与野生型蛋白相比，突变蛋白具有更广泛的相互作用残基网络，这种增加的相互作用密度有助于增强突变体复合物的稳定性和致密性。这些结果表明R193H突变在生化和结构水平上增强了cTnI和IRGM1之间的相互作用。

图1 cTnI或cTnIR193H与IRGM1相互作用

2. cTnIR193H小鼠心脏中IRGM1与cGAS的结合水平降低，从而激活cGAS-STING通路

鉴于cTnIR193H与IRGM1的相互作用增强，作者接下来研究了这种增强的相互作用是否会影响IRGM1介导的体内免疫调节功能。发现cTnIR193H突变增强了与IRGM1的结合，但不影响其表达。由于IRGM1可以通过其与cGAS蛋白的直接结合能力来降解cGAS，因此检查了IRGM1与cGAS的结合水平。发现与野生型相比，cTnIR193H杂合小鼠IRGM1与cGAS的结合水平显著降低，cGAS、STING以及下游磷酸化TBK1和磷酸化IRF3的蛋白质水平显著升高，同时血清和心脏组织中IFN-β水平显著升高。这些结果表明cTnIR193H小鼠的心脏表现出cGAS-STING-I型IFN信号轴的激活。为了确定这种免疫激活是否以心肌细胞自主的方式发生，作者在原代心肌细胞中过表达cTnIR193H，发现过表达cTnIR193H伴随着cGAS-STING通路的显著激活，以及细胞和细胞培养上清液中IFN-β水平的增加。

图2 cTnIR193H杂合小鼠心脏中cGAS-STING通路的激活

3. 抑制cGAS-STING通路或IRGM1过表达可部分挽救RCM的表型

为了评估cGAS-STING通路激活在cTnIR193H诱导的RCM中的功能，作者研究了cGAS-STING通路的抑制或功能恢复是否可以减轻cTnIR193H突变引起的心脏表型。结果显示，C176（STING抑制剂）处理后，cTnIR193H小鼠的心脏纤维化水平显著降低，舒张功能显著改善，心脏TBK1和IRF3的磷酸化水平降低，血清和心脏组织中IFN-β的水平也减弱，表明抑制cGAS-STING通路可以部分挽救cTnIR193H诱导的心脏表型。为了进一步评估IRGM1是否作为连接cTnIR193H与cGAS-STING激活的关键中介，作者在体外进行了救援实验，在原代心肌细胞表达cTnIR193H和IRGM1。结果表明IRGM1过表达显著抑制了cGAS-STING通路的激活，cGAS和STING表达减少，以及TBK1和IRF3磷酸化减少，细胞和细胞培养物上清液中的 IFN-β 水平均显著降低。这些结果支持了一个模型：cTnIR193H与IRGM1的互作增强伴随着IRGM1-cGAS相互作用受损，导致cGAS-STING通路激活并促进病理表型的发展。

图3 限制性心肌病中cGAS-STING通路的治疗性抑制

研究结论

本研究揭示了一种RCM发展模型：cTnIR193H与IRGM1相互作用增强，导致IRGM1介导的cGAS-STING通路调节功能受损，从而导致RCM中异常的先天免疫反应。这些发现可能为RCM的治疗提供一个新颖且有前景的靶点。

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