AAV在胰腺研究中的靶向策略（干货&应用合集）
胰腺是重要的分泌器官，由外分泌组织(腺泡)、内分泌组织(胰岛)、胰管和血管组成，这些结构的功能障碍会导致不同的胰腺疾病发生。鉴于胰腺的解剖位置和复杂结构，胰腺疾病的基因治疗需要针对不同胰腺部位进行有效的基因传递。多项研究表明，相比腺病毒和慢病毒而言，腺相关病毒更能有效转导胰腺，已作为一种明星载体在胰腺研究中展开应用。今天小V就带大家一起学习一下rAAV在胰腺基因工程中的选择策略。
一、血清型的选择
研究表明AAV8在胰腺中具有相对较高的转导效率。
Cheng H等研究证明，AAV8对胰腺的转导效率优于AAV1、AAV2、AAV5血清型，且持续表达时间较长（图1）；进一步通过胰腺导管给药观察不同血清型的组织分布发现AAV8可以高效转导胰腺组织（图2），并且转导效率呈剂量依赖式增加（图3）。
图1.不同AAV血清型和慢病毒对胰腺的转导效率比较
病毒：ssAAV1、2、5、8，LV
启动子：CMV
注射量：AAV：1011 VP；LV：1.5×107 IU
注射方法：胰腺导管给药
（Cheng, H., et al. J Biomed Sci, 2007.）
图2. 不同血清型AAV经胰腺局部给药后的组织分布
病毒：ssAAV1、2、5、8
启动子：CMV
注射量：1011 VP
注射方法：胰腺导管给药
（Cheng, H., et al. J Biomed Sci, 2007.）
图3. AAV1和AAV8对胰腺转导的剂量反应
病毒：ssAAV1、8
启动子：CMV
注射量：108-1011 VP
注射方法：胰腺导管给药
· 维真AAV8感染小鼠胰腺效果图 ·
（Insulin：红色荧光 GFP：绿色荧光）
病毒产品：AAV8-insulin-GFP
病毒用量：1012 vg
注射方法：胆总管(十二指肠壶腹开口处)
二、AAV载体的选择
研究表明scAAV对胰腺的转导效率也较高，且不同血清型转导效率与给药方式、启动子和注射量等密切相关。体外感染分离的胰岛时，scAAV6的感染能力强于scAAV1、scAAV2和scAAV8；通过全身给药时（腹腔体内注射），scAAV8比scAAV6转导效率强（图5）；而通过胰腺导管给药时，scAAV6强于scAAV8、9，可以有效转导腺泡、导管、胰岛在内的多种胰腺细胞（图6）。
图5.不同血清型dsAAV-CB-GFP载体对体外胰岛和体内胰腺的转导效率比较
病毒：scAAV1、2、5、6、8
启动子：CB
注射量：5×1011VG
注射方法：腹腔注射
（Wang, Z., et al. Diabetes, 2006.）
图6.胰腺导管给药时，scAAV6转导效率强于scAAV8、9
病毒：scAAV6、8、9
启动子：EF1α
注射量：1×1011VG
注射方法：胰腺导管给药
（Quirin, K.A., et al.Mol Ther Methods Clin Dev, 2018.）
三、启动子的选择
为了在胰腺特定细胞中实现AAV介导的转基因表达，可以选择胰腺组织特异性启动子，目前文献中推荐的启动子是胰腺β细胞特异性启动子Insulin和PDX1，可以有效介导基因在胰腺β细胞的特异表达。
四、注射方式的选择
在胰腺研究中，常用的给药方有腹腔注射、静脉注射和胰腺导管内注射。不同给药方式会影响AAV载体对细胞的转导能力。研究表明，与导管内给药相比，ssAAV8和ssAAV9载体对胰腺的系统性给药会导致其转导率降低.（参考文献“Safety and Efficacy of AAV Retrograde Pancreatic D)
因此，根据实验目的选择合适的注射方式十分重要。系统性给药方式（腹腔注射和静脉注射）的操作方式不再赘述，在此介绍一下胰腺导管内注射的操作方式（仅供参考）:
1、将小鼠进行麻醉后手术打开其腹腔，在胆囊底部切一小口，将特定的导管插入胆囊管中；
2、将导管置入总胆管，并在胆管和导管周围用微钳夹固定，以防止载体反流进入肝脏；
3、将微钳夹置于Oddi括约肌上，避免载体漏入十二指肠，将100μl AAV载体通过导管缓慢注入胰管，腺体均匀肿胀则证明给药成功；
4、灌注5min后取下上述两个微钳夹；
5、取出导管，手术缝合小鼠腹腔伤口。
6、术后，将小鼠放置在加热垫上待其恢复后放回笼子。
· 总结 ·
在胰腺研究中，不同AAV血清型转导效率与AAV载体选择、启动子以及给药方式等因素密切相关：
①通过胰腺导管给药方式，ssAAV8比ssAAV1、ssAAV2、ssAAV5转导效率强；
②通过全身给药，scAAV8比scAAV6转导效率强；通过胰腺导管给药方式时，scAAV6强于scAAV8、9；
③ssAAV8、9经胰腺导管给药比经全身给药转导效率强。
小V建议您实验前根据实验目的综合选择合适的载体、血清型、启动子和注射方式，以实现基因的高效长久表达。
客户案例分享1
“Autotaxin signaling facilitates b cell dedifferentiation and dysfunction induced by Sirtuin 3 deficiency”（IF=6.448）
外周组织β细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病（T2D）的主要病理生理学特征。β细胞去分化是导致β细胞功能缺陷进而促进T2D进展的因素之一。研究表明，控制β细胞去分化可作为改善β细胞功能的一种潜在治疗策略。此外，多项研究证实胰岛中SIRT3蛋白的表达与β细胞功能障碍密切相关。
先前的研究已发现，β细胞Sirt3特异性敲除的小鼠在HFD喂食后，糖耐量和胰岛素分泌受损；胰岛Sirt3缺失后Enpp2（又称ATX）蛋白表达增强，Enpp2/ATX是一种具有溶血磷脂酶活性的分泌酶，可产生溶血磷脂酸(LPA)。在此研究中，作者假设ATX/LPA通路的激活促进了Sirt3缺陷β细胞的去分化，并将LPA或LPC（ATX可将其水解产生LPA）应用于Sirt3缺失的MIN6细胞系和小鼠胰岛，以研究LPA对β细胞去分化的影响及其潜在机制。
研究显示在Sirt3缺失的MIN6细胞和小鼠胰岛中，ATX表达上调导致LPC增加，进而使LPA产生增加。LPA的增加不仅诱导了MIN6细胞和小鼠胰岛的可逆去分化，而且还减少了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。机制上，ATX/LPA通过诱导JNK/p38 MAPK磷酸化促进β细胞脱分化。使用AAV8体内抑制ATX（AAV8-Atx-shRNA）可以改善HFD喂养的Sirt3缺失小鼠的胰岛素分泌并减少β细胞的去分化。
图7. Sirt3-ATX/LPA通路在胰腺β细胞去分化中的作用机制
基因信息：Atx，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶蛋白家族成员
病毒产品：AAV8-Atx-shRNA、AAV8-scramble（insulin 1启动子）
实验动物：8周龄雄性小鼠
注射方式：腹腔注射
注射量：1×1012 genome copies
注射体积：100 μL
研究者使用腺相关病毒载体AAV8选择性抑制了ATX在正常小鼠和Sirt3 f/f;Cre/+小鼠胰岛中的表达。病毒注射8周后，进行6周的HFD喂食。胰岛ATX蛋白水平的降低证明了AAV8病毒的有效传递。随后的多项实验测试表明胰脏β细胞中ATX的敲低不仅可以挽救HFD诱导的葡萄糖耐受不良，恢复胰岛素的分泌，还减弱了HFD诱导的Sirt3 f/f;Cre/+小鼠中JNK/p38 MAPK信号的激活，抑制β细胞的去分化。这些结果证实了ATX在体内对β细胞去分化的病理作用。
图8. Sirt3 f/f;Cre/+小鼠ATX的特异性敲低改善了HFD诱导的葡萄糖耐受不良
图9. Sirt3 f/f;Cre/+小鼠ATX的特异性敲低改善了HFD诱导的β细胞去分化
案例分享2
“HRD1 an important player in pancreatic β-cell failure and therapeutic target for type 2 diabetic mice”（IF=9.461）
2型糖尿病(T2D)是一种以血糖持续升高为特征的慢性代谢性疾病，研究报道胰脏β细胞衰竭导致的胰岛素分泌不足与T2D的发生发展密切相关。HRD1 (HMG-CoA reductase degradation 1)，是内质网应激相关E3泛素连接酶的代表，通过靶向并有效降解错误折叠的胰岛素原维持胰岛β细胞的功能，HRD1的缺失会导致胰岛素分泌（GSIS）受损。研究报道HRD1在 Akita糖尿病小鼠胰岛中表达上调。NCBI GEO数据库的基因组数据显示，T2D患者胰岛细胞HRD1 mRNA水平升高。然而，HRD1在胰岛β细胞中的特异性病理作用仍不明确。
大量的β细胞转录因子在成熟β细胞功能的维持中起着至关重要的作用，其中，转录因子v-maf 肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A（MafA）仅在胰腺β细胞中表达，是β细胞形成和功能所需的关键因子。尽管泛素诱导的降解是糖尿病条件下β细胞中MafA减少的主要原因，但E3泛素连接酶在调节MafA活性中的具体作用仍有待探索。
在本研究中，研究者发现HRD1在T2D病人和T2D小鼠胰岛中过度表达。功能研究表明，β细胞HRD1的特异性过表达引发了胰岛素分泌受损，最终导致严重的高血糖;相反，在糖尿病模型中，HRD1基因的下调改善了血糖控制和反应。蛋白质组学分析表明HRD1与β细胞功能调控因子MafA可能存在相互作用。机制上，HRD1作为E3泛素连接酶，在糖尿病β细胞中靶向MafA的泛素化和降解，导致细胞质中MafA的积累，并降低其在细胞核中的生物功能，进一步导致β细胞功能障碍。本研究揭示了HRD1可作为2型糖尿病的治疗靶点，确立了靶向HRD1对T2D治疗的重要性。
基因信息：HRD1
病毒产品：AAV8-MIP–shHRD1–GFP、AAV8-MIP-HRD1-GFP、AAV8-GFP-control
病毒滴度：1012 GCP/mL
注射方式：胰腺导管内注射，6 μl/min
研究人员通过胰腺导管给药AAV8-MIP-shHRD1-GFP，注射入雄性C57BL / 6J小鼠胰腺导管，特异性敲低小鼠β细胞中的HRD1，免疫荧光证实了AAV载体在体内的有效传递（图10）。
图10. 胰腺导管给药AAV在体内的有效传递
随后作者将AAV8-MIP-shHRD1注射入HFD饲喂的糖尿病小鼠胰腺导管，2周后，糖尿病小鼠空腹血糖明显下降。4周后，糖耐量试验（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT）结果显示糖尿病小鼠血糖反应和血清胰岛素水平明显改善。AAV-shHRD1注射db/db小鼠的葡萄糖反应也有改善。综上结果表明HRD1在胰岛β细胞功能障碍和糖尿病中发挥重要作用。
图11. 抑制HRD1可改善糖尿病小鼠高血糖和葡萄糖耐受不良
研究人员通过胰腺导管内注射AAV8-MIP-HRD1，注射后胰岛HRD1蛋白水平明显升高，小鼠的空腹血糖和复餐血糖水平显著升高，获得β细胞HRD1特异性过表达小鼠。IPGTT结果显示糖代谢严重受损，HRD1特异性过表达的小鼠血浆胰岛素水平表现紊乱。上述结果表明β细胞HRD1上调可诱发高血糖并损伤胰岛素的分泌。
图12. HRD1过表达引发高血糖和葡萄糖耐受不良
案例分享 3
“Inhibition of miR-155 reduces impaired autophagy and improves prognosis in an experimental pancreatitis mouse model”（IF=8.469）
急性胰腺炎（AP）是一种胰腺炎症疾病，其特征是蛋白酶异常激活、实质损伤、胰腺自消化、腺泡细胞凋亡和坏死以及强烈的炎症反应。AP的早期阶段，胰腺的损伤和炎症会引起全身炎症反应综合征（SIRS），可导致单个或多个器官衰竭，这也正是AP早期发病和死亡的主要原因。然而，AP引起的器官衰竭的病理机制还尚未阐明。
MiR-155是一种在炎症反应促进和抗炎通路激活抑制中发挥重要作用的miRNA，已有研究表明，miR155在胰腺炎样本中表达上调。已知自噬受损可促进酶原激活、腺泡细胞分泌异常、细胞死亡和炎症反应进而加重AP；此外，有研究表明miR-155在多种疾病中促进自噬。本研究旨在通过调节自噬探究miR-155对AP病程的影响。
基因信息：miR-155
病毒产品：AAV9-miR-155、AAV9-miR-155 sponge
注射体积：病毒稀释液50 μL
注射方式：尾静脉注射
检测时间：注射3周后
首先，本研究构建了AP小鼠模型，利用AAV9载体介导miR-155和miR-155 sponge在AP小鼠胰腺中进行有效传递，发现miR-155靶蛋白TAB2的表达受到明显调控。此外，miR-155表达的调节可以影响蛙皮素诱导的AP严重程度，进一步研究发现沉默miR-155可以抑制不能与溶酶体融合的自噬小体的积累，并通过靶向TAB2减少胰腺炎症，从而改善AP模型小鼠的胰腺和肺损伤。此外，自噬抑制剂3-MA可以减少自噬小体的异常积累，从而减轻因miR-155水平升高而加重的胰腺损伤。本研究表明调节miR-155的表达可能是治疗或预防胰腺炎的一种潜在策略。
图13. AP中miR-155和自噬的调节机制
研究者通过小鼠尾静脉注射AAV介导的miR-155和miR-155 sponge，3周后检测miR-155的表达量，发现AAV9介导的miR-155在胰腺中有效传递，并且高滴度的AAV9对miR-155的表达影响更为显著（图14）。
图14. AAV9介导的miR-155在胰腺中有效传递
进一步研究miR-155的调控对蛙皮素诱导的AP程度影响，通过胰腺水肿、炎症细胞浸润、腺泡细胞的病理改变以及淀粉酶和脂肪酶水平，发现上调miR-155可以加重蛙皮素诱导的AP严重程度，而下调miR-155可能对实验性胰腺炎具有保护作用。
图15. miR-155表达的调控影响蛙皮素诱导的AP严重程度
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