IF 21.1 线粒体“黑化”启动骨关节炎软骨钙化？空军军医大学牛丽娜、焦凯教授团队揭示骨关节炎早期病变新机制

研究背景

骨关节炎（OA）是常见的退行性关节疾病，影响着全球数亿人口。软骨钙化是骨关节炎的核心病理特征，磷酸钙结晶在病变关节中的沉积与关节破坏程度正相关，且钙化并非骨关节炎的继发产物，而是驱动疾病进展的始动因素。了解病理性软骨钙化的机制对于制定有效的策略来遏制骨关节炎的进展至关重要。 

空军军医大学牛丽娜、焦凯教授团队在Science Bulletin（IF 21.1）上发表了题为“Mitochondria serve as a source of mineral precursors initiating early cartilage calcification in osteoarthritis”的文章，研究发现在骨关节炎的病理性软骨钙化中，矿物前体起源于线粒体，阐明了线粒体介导骨关节炎早期软骨钙化的分子机制，为早期干预骨关节炎提供了全新的治疗靶点。

· 维真助力 - AAV&慢病毒 ·

研究结果

1、线粒体内颗粒在软骨钙化中的作用

首先，研究人员在C57BL/6J小鼠的颞下颌关节(TMJ)和膝关节诱发骨关节炎，组织学检查证实了骨性关节炎的发展，小鼠软骨内出现病理性钙化。骨关节炎诱导一周后，未染色的电子显微镜检查显示线粒体基质内有高电子密度颗粒，元素分析证实该颗粒钙、磷含量较高，颗粒直径明显大于对照组。对线粒体中富含矿物质的颗粒的鉴定表明，其可能是骨关节炎软骨钙化的矿物质来源。进一步用透射电子显微镜观察了高电子密度颗粒在不同样品中的分布，发现线粒体衍生的矿物质可能通过基于囊泡的运输参与软骨钙化。流式细胞术分析发现，与对照组相比，在骨关节炎条件下有更多线粒体衍生的富钙小泡，将该囊泡与胶原共培养可诱导明显矿化，而非线粒体来源的富钙囊泡矿化能力弱，对照组无矿化。表明与病理性软骨钙化相关的囊泡中的矿物质来自线粒体，并在体内实验中证实了该现象；以上结果表明线粒体内颗粒是软骨钙化的矿物质前体。

图1. 线粒体内颗粒是早期软骨钙化的矿物质来源

2、线粒体 DNA（mtDNA）参与线粒体内矿化前体的形成

已有研究表明DNA可以促进病理性钙化及其与线粒体的密切联系，假设mtDNA可能作为线粒体内病理性矿化的中介。利用QPCR检测早期骨性关节炎模型软骨细胞的线粒体DNA拷贝数，诱导OA后1周，mtDNA 拷贝数无显著变化，中晚期（3/6 周）拷贝数下降，可能是因细胞应激线粒体生物发生产生影响。随着骨性关节炎的进展，茜素红评估的钙化明显加强。值得注意的是，新出现的钙化区域主要位于线粒体DNA附近或与线粒体DNA共同定位。这种时空相关性强烈地表明，线粒体DNA空间积聚是骨关节炎进展过程中先于并可能协调随后的病理性钙化过程的早期事件。免疫荧光和CRISPR-dCas9活细胞荧光原位杂交证实，早期骨关节炎中mtDNA与钙在线粒体中共定位，且共定位水平显著高于对照组；钙和mtDNA还会从线粒体协同释放至胞质，荧光共振能量转移进一步验证了二者的结合。表明了mtDNA与钙在软骨细胞中的共存，提示mtDNA可能在骨关节炎条件下矿物前体的形成中发挥作用。体外实验证实mtDNA可稳定钙磷，形成无定形矿化前体；mtDNA 耗竭会破坏矿化前体的形成，无法诱导病理性钙化。

图2. 线粒体DNA介导的钙和磷对矿物前体形成的稳定作用

3、CHCHD6缺失是导致mtDNA异常聚集的核心原因

在骨关节炎条件下，线粒体内mtDNA分子发生聚集，转变为相互连接的网状结构。研究人员将不同空间特征的mtDNA与饱和浓度的钙和磷混合进行体外测试，发现骨关节炎条件下提取的mtDNA能够稳定钙和磷、形成无定形的功能性矿化前体，而对照组的mtDNA 与钙磷结合后形成无功能的针状聚集体。通过线粒体蛋白质组学筛选差异表达蛋白，并结合文献筛选出4个与mtDNA分布相关的候选蛋白，对其进行上调/下调干预后发现，仅 CHCHD6的上调能显著减少体外培养软骨细胞的病理性钙化。CHCHD6是线粒体内膜复合体的组成成分，免疫共沉淀实验证实其与MICOS复合物的CHCHD3、mitofilin存在相互作用，可通过调控线粒体嵴的结构稳定性来影响mtDNA的空间分布。实验表明，CHCHD6 的缺失会导致线粒体嵴的结构紊乱，进而引发mtDNA分子的异常聚集；而上调CHCHD6 则能逆转mtDNA的聚集，减少矿化前体形成。利用AAV在体内靶向上调软骨细胞中 CHCHD6的表达，结果显示关节软骨的病理性钙化显著减少，证实与对照组相比，CHCHD6 的上调能更好地减弱骨关节炎的病理性钙化。研究人员进一步构建了包被线粒体靶向肽 SS31、可靶向线粒体的负载CHCHD6脂质体，将其混合到ROS响应性可注射 HAMA/PBA-HA水凝胶中，通过微流控技术制成水凝胶微球；该微球可将CHCHD6高效递送至软骨细胞的线粒体，且不会显著增加细胞死亡率，有效避免了全身性过表达 CHCHD6带来的潜在副作用。

图3. 线粒体靶向CHCHD6的微球阻止矿物质前体的形成，并阻碍骨关节炎的进展

实验结论

本研究表明当线粒体DNA聚集成网状结构时，矿物前体来自软骨细胞的线粒体，解决了与早期软骨钙化相关的一个重大知识缺口。通过阐明这些机制，有助于更全面地了解软骨钙化的早期发病机制，确定潜在的治疗干预目标，以防止或减缓病理性钙化。