『CircRNA领域新发现』浙江大学范顺武教授课题组发现CircRNA :CircSERPINE2,为骨关节炎治疗提供有效策略

环状RNA（circular RNAs，CircRNAs）是一类特殊的非编码RNA分子，不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共价键形成环形结构，具有组织特异性和高度保守性，广泛存在于哺乳动物细胞中。与线性RNA相比，CircRNA分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。一些CircRNAs富含miRNA结合位点，在细胞中可以作为miRNA海绵（miRNA sponge）或竞争性内源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），自动隔离或竞争性抑制miRNA的活性，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用，提高靶基因的表达水平。最近不断发现circRNA在不同研究领域和研究方向的新功能，circRNA已成为RNA研究领域的最新热点，吸引着无数科研工作者的目光。

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是一种由增龄、肥胖、劳损、创伤等诸多因素引起的退行性病变，主要特征是软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、活动受限和关节畸形等，多发于中老年人。科学家研究发现CircRNA表达水平的改变与OA发生有关，浙江大学医学院附属邵逸夫医院范顺武教授带领的团队在对OA研究中发现了一种新的CircRNA，（hsa_circ_0008365，命名为CircSERPINE2），CircSERPINE2过表达通过miR-1271 - ERG通路缓解软骨细胞（HCs）凋亡及促进胞外基质（ECM）的合成代谢，在OA治疗中可发挥积极作用。

研究结果

1.CircRNA在正常人体及OA患者组织中的表达

临床OA患者和正常人体组织进行RNAseq分析，发现OA组CircRNA表达呈现差异。RT-qPCR分析确定了25个表达差异最大的CircRNA及14个下调的CircRNA。作者用白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α处理的的原发性人类软骨细胞(HCs)试验证实了包含hsa_circ_0008365在内的六种CircRNA在OA样本组织中表达下调。Sanger测序法确定hsa_circ_0008365是由Serpine2基因的第二个至第四个外显子环化组成，即5’端剪接位点和外显子3’端相应位点形成的头尾剪接，因此命名为CircSERPINE2。

OA患者和正常人体软骨细胞中CircSERPINE2的表达水平检测显示，CircSERPINE2在OA样本呈表达下调模式，在HCs的细胞质中大量表达（图1）。

图1 CircSERPINE2在OA软骨组织和细胞中的验证和表达

2.CircSERPINE2调节软骨细胞的凋亡和ECM代谢

为了评估CircSERPINE2参与了基质降解酶的调控，作者用CircSERPINE2小干扰RNA转染HCs，发现CircSERPINE2表达下调并不影响SERPINE2的mRNA水平，而是增加HCs的凋亡率，CircSERPINE2的过表达可明显抑制IL-1β诱导的HCs凋亡率。WB结果显示抑制CircSERPINE2的表达增加了MMP3、MMP13和ADAMTS4（基质降解相关酶）的表达，降低SOX9、COL2A1和aggrecan的表达。IF和RT-qPCR结果再次证实，CircSERPINE2表达的下调显著影响了HCs和SW1353细胞（人骨肉瘤细胞）中MMP13、ADAMTS4、COL2A1和aggrecan的表达水平，CircSERPINE2的下调促进了HCs和SW1353细胞凋亡和代谢过程（图2）。

图2 CircSERPINE2表达下调诱导软骨细胞基质降解酶的表达

3.CircSERPINE2是miRNAs的吸附海绵

研究发现OA组织中有191个miRNA表达上调，CircSERPINE2可下调miR-1271和miR-93的表达。WB结果显示miR-1271与基质降解和合成蛋白的表达有关，而miR-1271在10个OA样本软骨中表达上调。荧光素酶检测和FISH实验证实CircSERPINE2与miR-1271结合。miR-1271过表达的细胞凋亡率升高，伴随MMP3、MMP13和ADAMTS4表达的增强，SOX9、COL2A1和aggrecan表达的降低。抑制miR-1271的表达时，基质降解和合成相关蛋白的表达水平则与此相反（图3）。

图3 CircSERPINE2作为miR-1271的海绵在HC细胞发挥作用

4.CircSERPINE2通过靶向miR-1271的表达在OA中发挥作用

将sh-CircSERPINE2和miR-1271海绵腺病毒共感染细胞。已知下调CircSERPINE2的表达可增加HC的凋亡率，而抑制miR-1271和CircSERPINE2的表达可显著挽救HC的凋亡率。与单独感染sh-CircSERPINE2和miR-1271海绵腺病毒的细胞相比，共感染sh-CircSERPINE2和miR-1271海绵腺病毒的细胞中，MMP13、MMP3和ADAMTS4的蛋白和mRNA水平显著降低，SOX9、COL2A1和aggrecan的蛋白和mRNA水平则显著提高。IF结果显示与用CircSERPINE2抑制剂处理过的细胞相比，CircSERPINE2和miR-1271表达抑制剂处理的细胞中，COL2A1和aggrecan表达水平升高，而MMP13和ADAMTS4表达水平降低，表明CircSERPINE2在体外通过靶向miR-1271发挥作用（图4）。

图4 miR-1271表达下调逆转HC细胞CircSERPINE2诱导的软骨降解

5.miR-1271直接作用于ETS相关基因

miR-1271和CircSERPINE2作用靶点研究发现E26转化特异性相关基因（ERG）对COL2A1、aggrecan、MMP3和MMP13表达水平的影响最为明显，在OA受损软骨区域显著下调。ERG是miR-1271的一个预测靶标，荧光素酶检测结果显示，miR-1271 mimic明显抑制转染WT ERG 3 ' -UTR细胞的荧光素酶活性，降低ERG的蛋白和mRNA表达水平，而miR-1271 inhibitor则显示出相反的作用。ERG过表达降低MMP3、MMP13和ADAMTS4的表达，提高SOX9和COL2A1的表达，表明miR-1271确实靶向ERG，内源性ERG表达与OA发病机制密切相关。

Pre-miR-1271腺病毒感染抑制ERG的表达，明显降低HCs中COL2A1、SOX9和aggrecan的表达，增加MMP3、MMP13和ADAMTS4的表达，ERG过表达后这些作用被消除。表明miR-1271过表达通过调节ERG损害软骨表型（图5）。

图5 ERG是miR-1271的直接靶点，介导miR-1271在HC细胞中的功能

6.注射CircSERPINE2可缓解OA兔的症状

为了确定CircSERPINE2是否在体内OA的进展中发挥作用，作者将WT或MUT腺相关病毒(AAV) CircSERPINE2（由维真生物构建和包装）通过关节内注射入前交叉韧带横切(ACLT)诱导的OA兔体内。结果显示OA兔在注射WT AAV CircSERPINE2后软骨表面得到了改善，而注射MUT AAV CircSERPINE2则无改善。国际骨关节炎研究协会(OARSI)评分显示，WT AAV CircSERPINE2显著降低了OARSI评分，而MUT AAV CircSERPINE2则提高了OARSI评分。显微CT图像显示OA兔骨赘增加，而关节内注射CircSERPINE2的OA兔骨赘减少。免疫组化和WB结果显示，注射WT AAV CircSERPINE2减轻兔OA模型软骨基质的退行性变化，如细胞凋亡增强和分解代谢反应增强，ECM组成增加。综上所述，CircSERPINE2的升高在抑制ECM分解代谢、促进合成代谢和减轻体内OA方面具有积极作用（图6）。

图6 CircSERPINE2减轻OA兔症状

小结

本研究发现circRNA：CircSERPINE2 通过SERPINE2基因第2个至第4个外显子反向拼接产生，其序列在人与兔之间较为保守，是一个参与OA的关键下调circRNA；CircSERPINE2含有保守的miR-1271靶点，miR-1271在OA中的表达显著上调，且与SOX9、aggrecan和COL2A1的表达呈负相关， CircSERPINE2通过靶向miR-1271-ERG途径抑制HCs凋亡，促进ECM合成并抑制ECM分解代谢，发挥抗OA作用。CircSERPINE2-miR-1271-ERG轴将成为预防和治疗OA的新靶点。