IF=8.702｜北京协和医院研究团队发现血-睾屏障调控新机制！

研究背景

睾丸支持细胞构成的血液-睾丸屏障（BTB）对于维持精子产生的独特微环境至关重要。去甲基化酶ALKBH5在小鼠睾丸支持细胞中大量表达，并以m6A依赖的方式调节精子产生，但目前尚不清楚ALKBH5是否参与BTB的调节。在本研究中作者利用AAV8 -shALKBH5构建了睾丸支持细胞特异性ALKBH5敲低小鼠，用以探讨ALKBH在BTB中的功能，发现ALKBH5通过调控Cdh2 mRNA翻译来调节BTB完整性。

结果展示

1. 睾丸支持细胞中的ALKBH5参与BTB完整性的调节

作者通过前期研究发现ALKBH5在小鼠睾丸支持细胞中大量表达，为了阐明支持细胞ALKBH5与BTB之间的联系，作者利用AAV8-shALKBH5构建了支持细胞ALKBH5特异性敲低小鼠模型，BTB完整性测定表明，ALKBH5敲低小鼠的曲精小管BTB完整性受损，但对照小鼠的曲精小管中BTB未受损，表明支持细胞中的ALKBH5参与BTB完整性的调节。

图1 ALKBH5参与BTB完整性的调节

2. ALKBH5调节Cdh2 mRNA的m6A水平及其翻译

ALKBH5主要通过m6A（mRNA N6-腺苷酸甲基化）调控基因表达，为了研究ALKBH5调控BTB完整性的机制，作者将小鼠支持细胞TM4中的ALKBH5进行沉默及m6A-seq分析。发现ALKBH5表达降低后总体m6A水平增加，并鉴定出1416个高甲基化RNA和615个低甲基化RNA，其中一些基因集与形成BTB的细胞骨架相关。通过进一步的筛选发现ALKBH5沉默导致Cdh2 mRNA的m6A水平显著增加，其中Cdh2 mRNA编码BTB中的一种重要结构蛋白N-钙粘蛋白，m6A IP qPCR实验再次证实这一结果，此外作者还发现Cdh2 mRNA与ALKBH5蛋白结合，表明Cdh2 mRNA是支持细胞中ALKBH5的去甲基化底物。

图2 Cdh2 mRNA的鉴定

3. ALKBH5通过Cdh2调节BTB完整性

多聚体分析结果表明，沉默ALKBH5后Cdh2 mRNA翻译效率呈上升趋势，但没有观察到Cdh2 mRNA含量和选择性剪接方式的变化。因此，作者测定翻译相关的m6A结合蛋白与Cdh2 mRNA之间的关系，发现Cdh2 mRNA和IGF2BP1、IGF2BP2和IGF2BP3之间存在强烈相互作用，同时Igf2bp1, Igf2bp2及Igf2bp3的沉默均导致N-钙粘蛋白含量显著降低，Western blot实验发现N-钙粘蛋白表达在沉默Alkbh5后上调。这些结果表明：ALKBH5通过调节Cdh2 mRNA的m6A水平，并在IGF2BP1/2/3帮助下影响其翻译效率。N-钙粘蛋白是基底内质特化的重要结构分子，Alkbh5敲除小鼠睾丸中的基底内质特异性肌动蛋白束严重紊乱，表明小鼠睾丸支持细胞中的ALKBH5通过调节Cdh2 mRNA翻译效率，以调控血液-睾丸屏障的完整性。

图3 ALKBH5通过Cdh2调节BTB完整性

本研究发现，ALKBH5调节小鼠睾丸支持细胞Cdh2 mRNA的m6A水平，影响Cdh2 mRNA翻译效率，并通过N-钙粘蛋白参与调节基底内质特化，继而调控BTB的完整性。