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干货篇｜AAV在肌肉组织中的靶向应用策略

肌肉是人体的重要组成部分，不仅是多种肌营养不良疾病基因治疗的靶组织，还可作为生产和分泌治疗远端器官疾病功能蛋白的生物工厂，肌肉组织的这些特征使其成为开发基因治疗策略的通用平台，用于递送相关疾病功能基因。AAV载体是将基因转移到骨骼肌和心肌等肌肉组织的理想载体，经AAV转导后肌肉细胞可以表达功能性重组蛋白，并将这些蛋白分泌到血液中进行全身递送，通过这种策略用于糖尿病、动脉粥样硬化、血友病及癌症等的疾病治疗，目前由AAV介导的肌肉基因治疗已逐步迈入临床。本期我们整理了AAV在肌肉组织的靶向策略以及部分案例，希望对大家的研究有所帮助。

一、启动子的选择

在肌肉组织的研究中，除了可以选择CMV和CAG等常用的广谱启动子，还可选择肌肉特异性启动子MCK，以实现基因在肌肉中高效和特异性的表达。
维真生物肌肉组织特异性启动子可供选择：

名称	大小	来源	描述
MCK	1.3 kb	小鼠	肌酸激酶基因启动子
3×enhancer MCK	728 bp	小鼠	修改的肌酸激酶基因启动子

二、AAV血清型的选择

根据文献报道，AAV1、2、6、7、8和9均可有效转导肌肉组织，但若要实现基因在肌肉组织的更高特异性地表达，通常是建议结合合适的血清型、肌肉特异性启动子以及适当的给药方式来实现。
1、AAV9结合CK6启动子，通过颈静脉注射的方式可高效、选择性的将基因传递到骨骼肌。

AAV9结合CK6启动子经颈静脉注射后高效靶向缺血性骨骼肌

（Katwal AB, et al. Gene Ther. 2013）

实验动物	血清型	启动子	注射方式	病毒用量
成年雄性 C57BL/6小鼠	AAV9	CK6	颈静脉注射	4.15×10¹¹ vg/mouse

2、AAV1和AAV6均可有效靶向横纹肌，由于AAV6与肝素有较好的亲和力，与AAV1相比，无论是通过肌肉注射还是静脉注射，AAV6都能以更高的效率持续转导横纹肌。

相比AAV1，AAV6经肌肉注射后有效靶向横纹肌

实验动物	血清型	启动子	注射部位	病毒用量	注射体积
3月龄雄性 C57BL/6小鼠	AAV1 AAV6	CMV	双侧胫骨前肌	10⁸vg 10⁹vg 10¹⁰vg	25 μL病毒稀释液

相比AAV1，AAV6经静脉注射后有效靶向横纹肌

（Arnett AL, et al.Gene Ther.2013）

实验动物	血清型	启动子	注射部位	病毒用量	注射体积
3月龄雄性 C57BL/6小鼠	AAV1 AAV6	CMV	尾静脉注射	2x10¹²vg	200 μL

3、来自美国布罗德研究所和哈佛大学等研究机构的研究人员在小鼠和灵长类动物体内定向进化出一种工程化改造的AAV载体— MyoAAV，研究显示这种载体能够高效靶向肌肉组织，递送到肌肉组织的效率是传统病毒载体的10倍以上。同时，与传统递送载体相比，该载体在遗传性肌肉疾病中的治疗剂量降低大约100到250倍，可有效降低肝脏损伤和其他严重副作用的风险。

全身给药后，MyoAAV 1A可高效转导小鼠骨骼肌

（Mohammadsharif Tabebordbar，et al.Cell.2021）

实验动物	血清型	启动子	注射方式	病毒用量	检测时间
8周龄 C57BL/6J小鼠	AAV9、 MyoAAV 1A	CMV	系统注射	1E+12 vg （~4E+13 vg/kg）	注射后 2周

三、AAV给药途径的选择

载体给药途径可以影响AAV在体内的组织趋向性和转导效率。多种AAV给药途径可以实现局部或全身的肌肉基因转移，以达到不同的治疗目的，如肌肉注射、逆行经静脉肢体灌注、冠状动脉内灌注、再循环给药、腹腔注射和静脉给药，以及针对特定器官的方法比如心包内注射和心内膜注射等。
其中，肌肉注射简单方便，可以将载体输送到目标肌肉群，小鼠肌肉注射的常见部位包括胫骨前肌、腓肠肌和股四头肌；逆行经静脉肢体灌注针对更多的肌肉群，更加适合治疗影响大肌肉群的疾病；心包内注射通常用于新生动物，可同时转导心脏和隔膜；心内膜注射在犬和NHP模型中可实现心脏基因的整体递送；冠状动脉内灌注将治疗基因传递到心脏已应用于临床试验；腹腔注射和静脉给药可实现全身的肌肉基因转移，但易产生脱靶和免疫毒性。

方法		优点	缺点
原位注射	肌肉注射、逆行经静脉肢体灌注、冠状动脉内灌注、心包内注射、心内膜注射、再循环给药	转导效率高；靶向性强；低免疫反应；	不能转导大肌肉群
系统性注射	腹腔注射静脉给药	广泛转导大肌肉群乃至全身肌肉	高剂量载体需求易产生脱靶和免疫毒性；AAV血清型有限

下面简述肌肉注射方式的操作步骤：
1、对小鼠进行称重，腹腔注射甲苯噻嗪/氯胺酮混合液将小鼠麻醉；
2、对小鼠右胫前肌进行刮毛及消毒处理；
3、使用适当大小的注射器及针头，以避免触碰到坐骨神经的方式入针，将病毒载体注入右胫前肌；
4、将针头缓慢抽出，轻轻施加压力以防止回流；
5、将小鼠放在加热垫上直至恢复，然后放回笼中饲养观察，注射病毒4周后可检测转基因的表达。

小鼠肌肉注射示意图

（https://www.theodora.com/rodent_laboratory/injections.html）

四、不同注射方式的AAV给药剂量

注射方式	推荐剂量	推荐注射体积	推荐血清型	实验动物
静脉注射	1×10¹²~ 1×10¹⁴ vg/kg	200μl病毒稀释液	AAV6- AAV9	成年小鼠
肌肉注射	5×10⁸~ 5×10¹⁰ vg/site	胫前肌/腓肠肌： 20~25μL 股四头肌： 50~100μL	AAV1/2/ 6/7/8/9	成年小鼠
心包内注射（针对心肌）	2.5x10⁹~ 2.5x10¹¹ vg	50μL	AAV8 AAV9	新生小鼠
左心室壁注射（针对心肌）	5x10¹⁰~ 5x10¹¹ vg/rat	不超过250μL， 50μL/次（总量超过250μL可能会导致心脏损伤或者死亡）	AAV9	成年大鼠

注：选择的血清型和载体的浓度决定了每种注射方式的给药剂量，具体实验时应综合考虑各种因素。

五、参考文献

1、Wang D, et al.The potential of adeno-associated viral vectors for gene delivery to muscle tissue. Expert Opin Drug Deliv. 2014 Mar;11(3):345-364.
2、Qiao C, et al.Gene therapy in skeletal muscle mediated by adeno-associated virus vectors. Methods Mol Biol. 2011;807:119-40.
3、Katwal AB, et al. Adeno-associated virus serotype 9 efficiently targets ischemic skeletal muscle following systemic delivery. Gene Ther. 2013 Sep;20(9):930-8.
4、Arnett AL, et al.Heparin-binding correlates with increased efficiency of AAV1- and AAV6-mediated transduction of striated muscle, but negatively impacts CNS transduction. Gene Ther. 2013 May;20(5):497-503.
5、Gruntman AM, et al.Gene transfer in skeletal and cardiac muscle using recombinant adeno-associated virus. Curr Protoc Microbiol. 2013;Chapter 14:Unit 14D.3.
6、Kwong JQ, et al.The mitochondrial calcium uniporter underlies metabolic fuel preference in skeletal muscle. JCI Insight. 2018 Nov 15;3(22):e121689.
7、Wu Y, et al.Endothelium-targeted delivery of PPARδ by adeno-associated virus serotype 1 ameliorates vascular injury induced by hindlimb ischemia in obese mice. Biomed Pharmacother. 2022 Jul;151:113172.
8、Witcher PC, et al.Expression of Myomaker and Myomerger in myofibers causes muscle pathology. Skelet Muscle. 2023 May 1;13(1):8.
9、Mohammadsharif Tabebordbar，et al.Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species .Cell.2021

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