AAV在肌肉组织中的血清型、启动子、注射方式选择策略及案例

肌肉是人体的重要组成部分，不仅是多种肌营养不良疾病基因治疗的靶组织，还可作为生产和分泌治疗远端器官疾病功能蛋白的生物工厂，肌肉组织的这些特征使其成为开发基因治疗策略的通用平台，用于递送相关疾病功能基因。AAV载体是将基因转移到骨骼肌和心肌等肌肉组织的理想载体，经AAV转导后肌肉细胞可以表达功能性重组蛋白，并将这些蛋白分泌到血液中进行全身递送，通过这种策略用于糖尿病、动脉粥样硬化、血友病及癌症等的疾病治疗，目前由AAV介导的肌肉基因治疗已逐步迈入临床。本期我们整理了AAV在肌肉组织的靶向策略以及部分案例，希望对大家的研究有所帮助。

一、AAV靶向肌肉-启动子的选择

在肌肉组织的研究中，除了可以选择CMV和CAG等常用的广谱启动子，还可选择肌肉特异性启动子MCK，以实现基因在肌肉中高效和特异性的表达。

维真生物肌肉组织特异性启动子可供选择：

二、AAV靶向肌肉-血清型的选择

根据文献报道，AAV1、AAV2、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9均可有效转导肌肉组织，但若要实现基因在肌肉组织的更高特异性地表达，通常是建议结合合适的血清型、肌肉特异性启动子以及适当的给药方式来实现。

1、AAV9结合CK6启动子，通过颈静脉注射的方式可高效、选择性的将基因传递到骨骼肌。

AAV9结合CK6启动子经颈静脉注射后高效靶向缺血性骨骼肌
（Katwal AB, et al. Gene Ther. 2013）

2、AAV1和AAV6均可有效靶向横纹肌，由于AAV6与肝素有较好的亲和力，与AAV1相比，无论是通过肌肉注射还是静脉注射，AAV6都能以更高的效率持续转导横纹肌。

相比AAV1，AAV6经肌肉注射后有效靶向横纹肌

相比AAV1，AAV6经静脉注射后有效靶向横纹肌
（Arnett AL, et al.Gene Ther.2013）

3、来自美国布罗德研究所和哈佛大学等研究机构的研究人员在小鼠和灵长类动物体内定向进化出一种工程化改造的AAV载体— MyoAAV，研究显示这种载体能够高效靶向肌肉组织，递送到肌肉组织的效率是传统病毒载体的10倍以上。同时，与传统递送载体相比，该载体在遗传性肌肉疾病中的治疗剂量降低大约100到250倍，可有效降低肝脏损伤和其他严重副作用的风险。

全身给药后，MyoAAV 1A可高效转导小鼠骨骼肌
（Mohammadsharif Tabebordbar，et al.Cell.2021）

三、AAV靶向肌肉-给药途径的选择

载体给药途径可以影响AAV在体内的组织趋向性和转导效率。多种AAV给药途径可以实现局部或全身的肌肉基因转移，以达到不同的治疗目的，如肌肉注射、逆行经静脉肢体灌注、冠状动脉内灌注、再循环给药、腹腔注射和静脉给药，以及针对特定器官的方法比如心包内注射和心内膜注射等。

其中，肌肉注射简单方便，可以将载体输送到目标肌肉群，小鼠肌肉注射的常见部位包括胫骨前肌、腓肠肌和股四头肌；逆行经静脉肢体灌注针对更多的肌肉群，更加适合治疗影响大肌肉群的疾病；心包内注射通常用于新生动物，可同时转导心脏和隔膜；心内膜注射在犬和NHP模型中可实现心脏基因的整体递送；冠状动脉内灌注将治疗基因传递到心脏已应用于临床试验；腹腔注射和静脉给药可实现全身的肌肉基因转移，但易产生脱靶和免疫毒性。

下面简述肌肉注射方式的操作步骤：

1、对小鼠进行称重，腹腔注射甲苯噻嗪/氯胺酮混合液将小鼠麻醉；

2、对小鼠右胫前肌进行刮毛及消毒处理；

3、使用适当大小的注射器及针头，以避免触碰到坐骨神经的方式入针，将病毒载体注入右胫前肌；

4、将针头缓慢抽出，轻轻施加压力以防止回流；

5、将小鼠放在加热垫上直至恢复，然后放回笼中饲养观察，注射病毒4周后可检测转基因的表达。

小鼠肌肉注射示意图 （图片来源自网络）

四、AAV靶向肌肉-不同注射方式的给药剂量

注：选择的血清型和载体的浓度决定了每种注射方式的给药剂量，具体实验时应综合考虑各种因素。

五、AAV靶向肌肉-客户案例

前面分享了AAV在肌肉组织中的血清型、启动子、注射方式选择策略，现在精选了几篇AAV靶向肌肉组织的客户案例供大家参考~

自噬是一种进化上非常保守的由溶酶体介导的生物降解过程，对细胞内稳态具有重要的调控作用。自噬过程由复杂的分子网络调控，包括UNC-51样激酶1（ULK1）复合物、III类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)复合物及多种自噬相关基因。此外，磷酸化、糖基化、泛素化和乙酰化等在内的翻译后修饰（PTMs）也介导自噬发生。最近的研究表明，乳酸可以驱动组蛋白和非组蛋白的赖氨酸乳酸化，是一种新的翻译后修饰，并以糖酵解依赖的方式调节巨噬细胞、体细胞、癌细胞和脑细胞的基因表达和蛋白活性。然而，乳酸化是否参与调节自噬机制目前尚不清楚。华东理工大学的研究团队发现ULK1通过磷酸化乳酸脱氢酶A（LDHA）促进乳酸产生，并进一步乳酸化Vps34激活其激酶活性，促进细胞自噬发生和内体-溶酶体降解途径，揭示了糖酵解代谢产物乳酸调控细胞自噬的新机制，以及Vps34乳酸化在肌肉运动稳态和肿瘤进展中的作用。

自噬通过消除异常线粒体和内含体在维持骨骼肌稳态中起关键作用。通过强迫游泳实验评估Vps34乳酸化的生理功能，作者发现小鼠肌肉剧烈运动诱导AMPKα(Thr172)、总mTOR、ULK1 (Ser555)、LDHA (Ser196)的上调并产生大量乳酸，同时诱导细胞自噬，促进Vps34的乳酸化，增加PtdIns(3)P水平。将对照病毒、rAAV-Vps34WT或rAAV-Vps342KR注射进小鼠骨骼肌，4周后进行急性游泳运动，Vps34WT的给药增强了肌肉自噬水平，而给药Vps342KR使肌肉自噬水平部分受损。这些结果表明，Vps34的乳酸化是骨骼肌细胞自噬和细胞稳态所必需的。

Vps34的乳酸化在骨骼肌稳态中起重要作用

糖基化相关蛋白异常先天性肌营养不良(dystroglycanopathy)是一组新生儿或婴儿期起病、具有明显临床表现和遗传异质性的肌营养不良性疾病，FKRP基因的突变易导致dystroglycanopathy，疾病严重程度从轻度LGMD2I到重度CMD。近年来，针对该类疾病的AAV基因治疗和ribitol（核糖醇）治疗均显示出显著的疗效，然而每种治疗方法都有其优缺点。Atrium Health卡罗来纳医疗中心的研究团队在FKRP-P448L突变小鼠中检测了AAV基因治疗和ribitol的联合治疗效果。研究结果证实，长期单独使用核糖醇治疗可以改善营养不良小鼠的病理、肌肉功能和寿命，但联合AAV-FKRP基因治疗比单独治疗更有效，揭示了核糖醇与AAV基因疗法联合治疗FKRP相关肌营养不良的潜在益处。

为了研究核糖醇治疗联合AAV基因治疗的潜在益处，作者给5周大的P448L小鼠服用补充有5%核糖醇的饮用水，4周后单尾静脉注射高、低剂量的AAV9-FKRP。结果表明，FKRP基因治疗和核糖醇治疗可增加营养不良FKRP-P448L突变小鼠的体重并延长其寿命，同时增加小鼠心脏和骨骼肌中的基质聚糖。随着小鼠的衰老，小鼠的横膈膜会出现进行性纤维化，在治疗后6个月，未经治疗的P448L小鼠横膈膜表现出广泛的变性及纤维化，约占据组织区域的40%以上，核糖醇治疗的小鼠纤维化面积降到22%，而在高、低剂量AAV-FKRP联合治疗的小鼠中纤维化面积进一步降到12%，表明核糖醇和AAV-FKRP联合治疗可改善FKRP-P448L突变小鼠的病理学。

核糖醇联合AAV-FKRP基因治疗对P448L小鼠膈纤维化进展的影响

线粒体Ca2+单向转运蛋白（MCU）复合物介导急性线粒体Ca2+内流。在骨骼肌中，MCU通过直接增强线粒体中关键代谢酶的活性，将Ca2+信号传导与能量产生联系起来。辛辛那提儿童医院的研究人员通过建立胚胎、出生后和成年时期骨骼肌中靶向缺失MCU的小鼠模型，研究了MCU在骨骼肌发育和代谢功能中的作用。研究结果表明Mcu的缺失不会影响肌肉的生长和成熟，也不会引起病理，小鼠骨骼肌特异性Mcu缺失也不影响肌纤维细胞内Ca2+处理，但抑制了Ca2+刺激的急性线粒体Ca2+内流和线粒体呼吸，导致小鼠急性运动能力下降。然而，Mcu的损失也导致疲劳条件下肌肉性能的增强，优先转向脂肪酸代谢，导致体脂随着年龄的增长而减少。总之，这些结果表明，MCU介导的线粒体Ca2+调节是基线和生理需求增强条件下骨骼肌燃料选择的基础，影响了总的稳态代谢。

为了研究MCU对成年骨骼肌生长的贡献，一方面，研究人员将Mcufl/fl小鼠与SKa-MCM（在骨骼肌α-肌动蛋白启动子控制下表达他莫昔芬诱导的Cre重组酶）小鼠杂交，构建Mcu缺失小鼠。分析数据表明Mcu缺失小鼠骨骼肌线粒体中的MCU蛋白水平降低了90%以上，线粒体Ca2+摄取减弱，但这种损害并未影响小鼠肌肉重量和组织完整性。另一方面，研究人员将表达Cre重组酶的AAV9直接注射到6周龄的Mcufl/fl小鼠胫骨前肌（TA）中，将成年小鼠肌肉组织Mcu特异性敲除。病毒转导后8周，与AAV9-GFP对照组相比，AAV9-Cre转导小鼠的TA肌肉裂解物中MCU蛋白水平显著降低，但未观察到TA肌肉重量的变化，也没有组织病理学表现，总之，这些结果表明，MCU依赖性Ca2+信号的丧失与骨骼肌生长或组织结构的显著变化无关。

线粒体Ca2+内流不调节出生后骨骼肌的生长

糖尿病血管病变是造成糖尿病人群发病和死亡的主要原因，外周动脉疾病（PAD）是其主要形式之一。PAD是一种以向下肢提供血液和营养的动脉狭窄和闭塞为特征的动脉粥样硬化性心血管疾病，严重时可发展成重症肢体缺血（CLI），已知肥胖和胰岛素抵抗与PAD和CLI的发病率呈正相关。目前，抗炎、刺激血管重建和肌肉再生是治疗CLI的关键途径，但是由于缺乏有效的治疗靶点和途径，针对CLI的临床治疗效果是有限的。过氧化物酶体增殖物激活受体δ (PPARδ)是一种配体激活的核转录因子，属于核受体超家族。使用PPARδ激动剂激活PPARδ对血管内稳态和冠状动脉疾病有显著治疗效果，然而其副作用在很大程度上限制了该治疗方法的进一步应用。香港中文大学的研究团队探索了AAV载体介导的PPARδ传递对下肢缺血诱导的血管损伤的治疗效果，研究表明在肥胖和胰岛素抵抗的情况下，PPARδ在内皮稳态中发挥关键性保护作用。利用AAV1靶向内皮细胞转导PPARδ的基因疗法有助于缺血性损伤后功能性血管系统恢复，包括增强血流恢复，增加毛细血管密度，恢复内皮完整性，抑制血管炎症，并能促进肌肉的再生，突出了PPARδ在PAD和CLI患者治疗中的潜在巨大价值。

鉴于PPARδ在血管稳态中的作用具有非配体依赖性，研究人员探究了在HLI小鼠模型中恢复内皮细胞PPARδ的表达是否可以改善血管内皮功能障碍和促进血管修复。研究人员利用AA1-ICAM2成功在PpardEC-KO和PpardEC-WT小鼠体内进行了Ppard基因传递。数据分析表明，AAV1-Ppard加速了PpardEC-WT小鼠的下肢灌注恢复，同时也恢复了PpardEC-KO小鼠的下肢损伤。进一步的组织学分析表明， AAV-Ppard组在肌肉损伤后恢复更好，纤维化减少以及GA肌肉质量减少降低，尤其在 AAV-Ppard注射的PpardEC-KO小鼠中表现更为明显。此外，AAV-Ppard注射恢复了HLI损伤后PpardEC-KO小鼠的内皮细胞功能，抑制了血管炎症。

恢复内皮细胞PPARδ表达可改善HLI后PpardEC-KO小鼠血管功能

骨骼肌的发育和再生依赖于肌源性祖细胞的细胞融合来产生多核肌纤维，这些祖细胞利用Myomaker和Myomerger两种肌肉特异性融合原，它们通过重塑细胞膜相互融合或与现有肌纤维融合而发挥作用。Myomaker和Myomerger的表达仅限于分化祖细胞，因为它们在成年肌纤维中未被检测到，然而，肌营养不良小鼠的肌纤维中仍然表达Myomaker。辛辛那提儿童医院的研究团队评估了肌纤维区室中Myomaker和Myomerger活性的影响，研究发现肌纤维中Myomaker或Myomerger的表达在急性时间点独立引起膜损伤，这种损伤导致肌肉病理，表现为中央有核肌纤维和肌肉萎缩，与融合蛋白自身的表达相比，肌纤维中Myomaker和Myomerger的双重表达加剧了肌肉病理学。数据表明，虽然肌纤维可以耐受一定水平的Myomaker和Myomerger，但超过阈值的单个融合蛋白的表达或两种融合蛋白的共同表达对肌纤维是有害的，强调了在肌肉发生和融合过程中高度限制融合蛋白表达的必要性。

研究人员将AAV9-Myomerger或AAV9-GFP（对照）通过肌肉注射的方式注射到2月龄野生型小鼠的TA中，2周后收集肌肉进行Western印迹分析证实AAV9-Myomerger的成功转导。AAV9-Myomerger注射后观察到TA中心成核，表明肌纤维损伤和随后的再生；免疫荧光显示，与诱导型模型相比，AAV9-Myomerger在每根肌纤维上的表达显著更高，揭示肌纤维可能具有它们可以耐受的Myomerger表达阈值。

Myomerger表达升高导致肌肉再生

六、AAV靶向肌肉-参考文献

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