AAV在内耳的靶向应用策略（下）
AAV载体凭借其高安全性，低免疫原性等优势，可以安全地转导中枢神经系统和感官系统，并在多种疾病的基因治疗中显示出巨大潜力，这为遗传性耳聋的治愈带来了新的希望。目前，已有多项研究表明，使用AAV作为基因治疗载体可以部分或完全恢复遗传性耳聋小鼠模型的听力。上期内容，我们分享了关于AAV在内耳应用中的启动子和注射方式的选择策略：AAV在内耳的靶向应用策略（上），本期我们将继续分享内耳应用中AAV血清型、载体的选择和优秀案例。
一、AAV血清型选择
1、新生小鼠
①传统AAV血清型中，AAV1是新生小鼠内耳基因传递使用最广泛的血清型之一，可转导毛细胞、支持细胞、血管纹、前庭神经上皮多种细胞类型，并且通过圆窗膜注射方式可高效转导内毛细胞。其它血清型AAV2、AAV6、AAV8、AAV9以不同的效率感染新生小鼠耳蜗内毛细胞（图1）。
图1. 相比其它天然AAV，AAV1在体外可高效转导离体培养的小鼠耳蜗毛细胞
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
②与传统的AAV血清型相比，变体Anc80L65可介导靶基因在新生小鼠外毛细胞和内毛细胞中的高效稳定传递（图2）。
图2. 相比传统AAV血清型，Anc80L65在体外可高效转导小鼠耳蜗外毛细胞和内毛细胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
图3. 相比传统AAV血清型，Anc80L65在体内可高效转导新生小鼠耳蜗内毛和外毛细胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
③经后半规管注射后，变体AAV2.7m8可在体内高效转导新生小鼠外毛细胞和内毛细胞，并且在外毛细胞转导方面明显优于Anc80L65（图4）。此外，AAV2.7m8还能够感染支持细胞亚群(内柱细胞和内指细胞)(图5），这些支持细胞亚群被认为能够高效促进毛细胞再生。
图4. AAV2.7m8在体内高效感染新生小鼠耳蜗外毛细胞和内毛细胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
图5. AAV2.7m8在体内高效感染新生小鼠内耳支持细胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
④经胞囊注射后，相比Anc80L65和AAV2.7m8，AAV9-PHP.B在内毛细胞和外毛细胞中均具有强的转导效率，并在螺旋和前庭神经节神经元中显著转导。
图6. AAV9-PHP.B在体内高效感染新生小鼠耳蜗外毛细胞和内毛细胞
（Lee J, et al. Hear Res. 2020）
⑤通过RWM注射，新型突变体AAV-ie-K558R可以强烈诱导新生小鼠耳蜗中HC样细胞的再生
图7. AAV-ie-K558R-Atoh1可在新生小鼠体内再生HC样细胞
（Tao Y, et al.Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022）
2、成年小鼠
在成年小鼠中，相比于AAV1、AAV8、AAV9和Anc80L65血清型，AAV2可同时高效转导内毛细胞和外毛细胞，其次是Anc80L65血清型（图8）。
图8. AAV2高效转导成年小鼠耳蜗毛细胞
（Omichi R, et al.Mol Ther Methods Clin Dev. 2020）
二、双AAV载体选择
AAV有限的包装容量（约4.7kb）使其无法递送一些较大的基因，这在一定程度上限制了其疾病治疗范围，双AAV（或三AAV）载体技术的发展解决了这一难题。双AAV载体递送策略即将要递送的大片段基因拆分并包装到两个AAV载体上，其中一个AAV载体携带启动子元件和5’端外源基因CDS，另外一个AAV载体携带3’端外源基因CDS和polyA尾巴，载体两端为ITR序列。将这两个AAV载体共感染目的细胞后，外源基因的上下游部分根据AAV基因组的聚合能力进行重组，最终产生一个包含完整外源基因的mRNA转录本。目前常用的双AAV载体策略有三种：overlapping、trans-splicing和hybrid。
图9. 双AAV载体策略示意图
（Omar Akil. Hearing Research. 2020）
使用双AAV载体递送技术，可以将超过4 kb的编码序列转导到内耳，这为一系列由较大基因引起的遗传性耳聋的基因治疗开辟了可能性。例如，研究人员利用双AAV载体方法在DFNB9耳聋小鼠模型中成功实现了Otof基因cDNA编码序列（∼6 kb）的完整表达，实现转导细胞中Otof基因表达的持久恢复和耳聋表型的逆转，而且该治疗方法不仅可以在听力发作前预防Otof-/-小鼠的耳聋，而且在听力发作后给药还可以持续逆转耳聋表型，这为未来在DFNB9患者中进行基因治疗试验带来了希望。
图10. 双AAV载体恢复P10 Otof - /- 小鼠otoferlin表达并预防耳聋
（Akil O, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019）
· 小结 ·
不同的启动子、注射方式、血清型、病毒用量及载体递送形式等因素均会影响AAV在内耳的基因递送效率，因此以上数据仅供参考，建议您在具体实验之前查阅相关文献或技术资料，选择合适的策略开展实验。
三、优秀案例分享
文章题目：Template-independent genome editing in the Pcdh15av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness
合作客户：北京脑科学与类脑研究中心熊巍教授课题组
发表期刊：Cell Reports（IF9.995）
维真生物AAV2/9病毒感染耳蜗毛细胞效果图
参考来源
1、https://www.audiocure.com/inner-ear-disorders/；
2、Peters CW, et al. Delivering AAV to the Central Nervous and Sensory Systems. Trends Pharmacol Sci. 2021 Jun;42(6):461-474.
3、Gu X, et al. Transduction of Adeno-Associated Virus Vectors Targeting Hair Cells and Supporting Cells in the Neonatal Mouse Cochlea. Front Cell Neurosci. 2019 Jan 24;13:8.
4、Maguire CA, Corey DP. Viral vectors for gene delivery to the inner ear. Hear Res. 2020 Sep 1;394:107927.
5、Akil O, Lustig L.AAV-Mediated Gene Delivery to the Inner Ear. Methods Mol Biol. 2019;1950:271-282.
6、Suzuki J, et al. Cochlear gene therapy with ancestral AAV in adult mice: complete transduction of inner hair cells without cochlear dysfunction. Sci Rep. 2017 Apr 3;7:45524.
7、Askew C, et al.Tmc gene therapy restores auditory function in deaf mice. Sci Transl Med. 2015 Jul 8;7(295):295ra108.
8、Omichi R, et al.Hair Cell Transduction Efficiency of Single- and Dual-AAV Serotypes in Adult Murine Cochleae. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020 May 13;17:1167-1177.
9、Landegger LD, et al.A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 2017 Mar;35(3):280-284.
10、Isgrig K, et al.AAV2.7m8 is a powerful viral vector for inner ear gene therapy. Nat Commun. 2019 Jan 25;10(1):427.
11、Lee J, et al.Efficient viral transduction in mouse inner ear hair cells with utricle injection and AAV9-PHP.B. Hear Res. 2020 Sep 1;394:107882.
12、Akil O. Dual and triple AAV delivery of large therapeutic gene sequences into the inner ear. Hear Res. 2020 Sep 1;394:107912.
13、Akil O, et al. Dual AAV-mediated gene therapy restores hearing in a DFNB9 mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019 Mar 5;116(10):4496-4501.
14、Tao Y , Liu X , Yang L , et al. AAV-ie-K558R mediated cochlear gene therapy and hair cell regeneration[J]. Signal transduction and targeted therapy, 2022, 7(1):109.
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