实验小白专题：如何选择载体？

载体选择通常需要考虑以下三点因素：

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根据构建 DNA 重组体的目的（克隆扩增 / 表达），选择合适的克隆载体/表达载体。克隆载体与表达载体的区别可参考 克隆载体和表达载体 相关内容，做好载体选择是载体构建成功的第一步。

02 载体的类型

（1）克隆载体的克隆能力，尤其对于病毒载体来说，载体包装容量的大小是评估能否成功包装病毒载体的首要因素。

①腺病毒可以插入长约 8kb 的外源基因，是载体选择中适合大片段的病毒载体类型。

②慢病毒的包装容量约为 6kb（包含载体带有的其他抗性基因或报告基因），但是 2kb 以上的外源基因包装慢病毒难度就增加了，增大 1kb 会下降 1 个单位数量级的滴度，故 2kb 以上的基因包装慢病毒需要进行评估。此外，毒性蛋白、凋亡蛋白和膜蛋白（作为受体、转运蛋白行使功能）等由于其本身的功能，慢病毒包装可能会有一定难度，载体选择需谨慎评估。

③AAV 载体的总包装容量是 4.7 kb，插入目的基因一般约 2kb 左右。由于AAV 载体包装容量有限，目的基因大于 2kb，可考虑去除内含子，因为内含子只是有助于插入的目的基因稳定表达，AAV 载体在载体选择中更适合小片段基因递送。

（2）确定表达蛋白的目的，然后再来选择优势的表达质粒。一般分为原核表达和真核表达质粒载体，前者主要用于体外纯化蛋白，后者一般是细胞、体内表达等需要时所用，载体选择要匹配表达系统需求。

03

载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接，不产生阅读框架错位，合理利用多克隆位点 MCS是载体选择与载体构建的关键环节。

①选分子量小的质粒载体，即小载体（1-1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多；

②使用松弛型质粒载体在细菌里扩增不受约束，一般 10 个以上的拷贝，而严谨型质粒载体＜10 个，载体选择优先松弛型高拷贝质粒载体；

③必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地，多克隆位点 MCS丰富度影响载体选择适用性；

④必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，方便载体筛选与鉴定。

选择载体还需注意：

①对于无起始密码子和终止密码子的基因，插入无标签的载体要加入起始密码子和终止密码子。

②载体N端有标签，上游引物要对读码框；下游引物要加终止密码子(为了保证基因的表达,少翻译载体序列) 。

③载体C端有标签，上游引物要加起始密码子，且考虑是否加Kozak序列（真核表达系统）；下游引物要对读码框，并且要去掉基因本身的终止密码子（保证C端标签表达）。

添加Kozak序列有助于提高真核基因的转录和翻译的效率。