质粒构建常用技术汇总

构建载体的中心思想就是把目的序列正确插入到载体特定部位，通常是多克隆位点中。目前载体构建的常用方法有TA克隆、酶切连接、同源重组等。

TA克隆

TA克隆技术利用Taq聚合酶具有末端转移酶，但却不具有3'-5'端外切酶校准活性的特点，能在PCR产物的3'端加上一个非模板依赖碱基“A”。而经过特殊处理的T载体带有末端突出的碱基“T”，在连接酶的作用下，可与PCR产物末端的A连接，从而把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点中。

TA克隆可以将不确定具体序列信息的PCR产物连接到T载体上，在序列确认和基因克隆中经常用到。

酶切连接

酶切连接是最经典的载体构建方法。它是用相同的限制性内切酶消化质粒和含有目的片段的DNA，得到具有相同的粘性末端或平末端的线性DNA，酶切产物进行纯化后，再利用DNA连接酶将线性化质粒与DNA片段共价结合，得到重组质粒。

酶切连接实验中需要选择合适的酶切位点，酶切位点在载体和插入片段中需要单一，否则在酶切过程中会将载体和片段切成多段碎片。

同源重组

通过PCR技术使片段末端含有同源DNA片段，然后这些片段和酶混合物共孵育完成连接，该酶混合物含有三个不同的酶：核酸外切酶、聚合酶、连接酶。

外切酶用于消化片段末端序列，产生长突出末端，允许同源单链区域退火后配对为双链；聚合酶填补双链片段的其他缺口；连接酶活性能连接组装后的DNA切口。于是含有同源序列的两个或多个片段，在外切酶进行切割后，在同源序列处退火，而后在聚合酶和连接酶的作用下，产生一个完整的长链。