无缝克隆——让载体构建更简单

双酶切是载体构建的经典方法，但有一定的局限性，一方面该方法需要质粒载体、目的基因、限制性内切酶相互匹配后才能使用，另一方面该方法需经过PCR、酶切、纯化、连接、验证、转化等步骤，耗时较长，对多片段基因组装效果差，因此，简单快捷的无缝克隆技术应运而生。

无缝克隆技术原理

无缝克隆技术的原理是在目的基因两端添加载体的同源序列，通过同源重组的方式将目的基因连接至载体的特定位点中。目前主要有两种无缝克隆体系（Gibson Assembly和In-Fusion Cloning），两种体系都是通过外切酶产生黏性末端，之后在DNA聚合酶、连接酶的作用下获得重组载体，其中Gibson Assembly采用5’→3’核酸外切酶，In-Fusion Cloning采用3’→5’核酸外切酶。

在Gibson Assembly体系中，目的基因和线性化载体两端具有一段15bp左右的同源序列，在5’→3’核酸外切酶作用下，目的基因和载体DNA的5’端被逐渐降解，形成黏性末端，当降解的序列长度大于同源序列长度时，目的基因和载体DNA的3’端同源序列发生互补配对，形成一个在单链上有小缺失（gap）的环状载体，之后DNA聚合酶和dNTP修复gap，形成具有nick（断裂磷酸二酯键）的环状载体，并在DNA连接酶作用下形成磷酸二酯键，获得完整的重组载体。

无缝克隆优势

• 构建速度快：只需要一次反应（20-60min）即可获得重组克隆，省略酶切、电泳、纯化、酶连等过程；
• 对酶切位点无要求，不经酶切的目的片段可以插入到任意载体的任意位点；
• 连接过程中不会引入除目的基因和载体外的其他序列，实验结果更稳定；
• 通过设计不同的同源序列区，只需要一个反应，就可以在载体中按照特定顺序同时连入多个片段，或在多载体、多目的基因的混合体系中同时获得所需的多个重组载体。
• 已有多家公司推出无缝克隆试剂盒，可提高无缝克隆实验的成功率，降低实验周期。