逆转录病毒载体系统通常指的是称为γ逆转录病毒,表达系统由逆转录表达载体、辅助载体(表达病毒包装需要的蛋白质)和包装细胞系组成,由于逆转录病毒载体能将单链RNA(ssRNA)基因组转换为dsDNA分子,可以高效的将外源基因稳定的整合到哺乳动物细胞基因组,目前已被广泛应用于基因转移载体系统。逆转录病毒通常指的是称为γ逆转录病毒,包括MMLV(莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒)和MSCV(鼠干细胞病毒)。其优势之一是载体基因组永久整合到宿主基因组中,可长期稳定地表达转基因。但是由于无法穿过核膜,只能在细胞分裂过程中通过不完整的核膜来感染细胞,因此只能感染分裂期的细胞。其缺点主要体现在一是载体容量较小,二是包装的病毒滴度较低。从病毒应用来看,MMLV可以高效的将外源基因稳定整合到宿主基因组的病毒载体,在IPSC制备中也比较受欢迎,MSCV则比较适合胚胎干细胞、胚胎癌细胞、造血干细胞等的转基因表达。
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逆转录病毒介绍
逆转录病毒(Retrovirus),又称反转录病毒,是一类RNA病毒,需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA,新合成的cDNA插入宿主的核DNA中,随宿主DNA复制、转录、翻译达到扩增目的。逆转录病毒科可分为7个属:α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)、γ逆转录病毒属(Gammaretrovirus)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)、ε逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)、慢病毒属(Lentivirus)和泡沫病毒属(Spumavirus)。
逆转录病毒结构
逆转录病毒是一种RNA病毒,其两端为长末端重复序列(LTR),病毒颗粒为二十面体对称结构、球形,有包膜,表面有刺突,大小约80-120nm,基本结构包括包膜蛋白、基质、衣壳蛋白、核衣壳蛋白,以及病毒复制所需的酶(包括逆转录酶、整合酶、蛋白酶)。
逆转录病毒结构图
逆转录病毒基因组
逆转录病毒的基因组为二倍体,含两个相同单链RNA(+ssRNA),是一种连续线性单链RNA,长度为7-12 kb。简单逆转录病毒的基因组包含三个主要的编码段和一个小的编码域,主要片段包含三个基因gag、pol和env: gag基因编码病毒衣壳、基质等结构蛋白的基因,pol基因编码逆转录酶(p66/p51)、蛋白水解酶和整合酶,env基因编码gpl20和gp41两种包膜糖蛋白;小编码域包含前基因pro,该基因编码病毒蛋白酶。
逆转录病毒基因组结构图
(Endogenous Retroviruses in the Genomics Era)
逆转录病毒感染细胞过程
逆转录病毒只能在宿主细胞内复制,主要包括以下过程:病毒吸附在细胞表面,病毒包膜蛋白与细胞表面受体结合,囊膜与细胞膜融合,病毒颗粒进到细胞内,基因组RNA逆转录为双链DNA,进入细胞核并整合到宿主染色质上,转录产生病毒RNA;病毒RNA从细胞核迁移到细胞质中,翻译产生病毒蛋白,经过自组装后,包裹病毒基因组RNA形成未成熟病毒颗粒,以出芽的方式释放到细胞外,经病毒蛋白酶剪切多蛋白,成为成熟的子代病毒颗粒。
逆转录病毒可以与多种细胞表面蛋白结合而进入细胞,其宿主细胞范围很广,主要由病毒颗粒表面的包被蛋白(env)决定。
逆转录病毒特点
1、逆转录病毒具有广泛的宿主范围,可以广泛感染多种细胞类型,且整合率高;
2、逆转录病毒能与宿主细胞DNA整合,可以介导外源基因稳定、长期表达;
3、逆转录病毒主要感染分裂期的细胞,适用于干细胞相关的研究。
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3、载体全,可进行MMLV(莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒)和MSCV(鼠干细胞病毒)的逆转录病毒包装;