腺病毒(Adenovirus,Ad)是一种无包膜的DNA病毒,其复制不依赖于宿主细胞的分裂。腺病毒拥有近50个血清型,大多数腺病毒载体都是基于血清型2和血清型5,通过转基因的方式取代E1和E3基因,降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1基因的细胞中复制,因此是一种适用于治疗的高效控制系统。重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具,功能强大并易于操作。腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”,被科研工作者广泛使用。
维真生物成立之初,其研发团队就建成了涵盖12000多种人源基因的腺病毒库,具体信息见人源ORF腺病毒。产品自2013年面市后,公司也定制了很多腺病毒包装项目。因此,维真生物拥有丰富的腺病毒包装经验,可为客户提供体内外实验所需的各种规格腺病毒,以满足客户多样化的实验需求。下面是具体服务内容(目录价仅为病毒包装费用):
服务编号 |
服务类型 |
规格 |
目录价 |
货期 |
WZ050001 |
小包装、非纯化 |
滴度=1×10E10-11 vp/ml;体积1ml |
询价 |
3-4周 |
WZ050002 |
中包装、纯化 |
滴度≥1×10E10 pfu/ml;体积1ml |
询价 |
4-5周 |
WZ050003 |
大包装、纯化 |
滴度≥1×10E11 pfu/ml;体积1ml |
询价 |
4-5周 |
*如您对上述服务感兴趣,请您点击“欢迎垂询”留下您的信息,我们将为您提供具体实验方案和项目价格。
↓↓ 分以下几个部分做详细介绍 ↓↓ |
腺病毒(AdV)结构
腺病毒是一种直径为90-100nm的病毒颗粒,衣壳呈廿面体,由240个六邻体和12个五邻体组成。以五邻体蛋白为基底由衣壳表面伸出12根纤毛,纤毛顶端形成头节区。五邻体和纤毛的头节区可与细胞表面的受体结合,在病毒感染细胞过程中起着非常重要的作用。右面是腺病毒的结构示意图: |
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腺病毒是一种双链线性的DNA病毒,其基因组长度约为36kb。基因组两端各有一个103 bp的反向末端重复序列(inverted terminal repeat, ITR),参与病毒DNA的复制;ITR的内侧为病毒包装信号Ψ,参与腺病毒基因组的衣壳化。基因组包含早期表达的与腺病毒复制相关的E1~E4基因和晚期表达的与腺病毒颗粒组装相关的L1~L5基因。下图是人类血清5型腺病毒基因组的示意图:
基于人血清5型腺病毒的基因组结构,结合各基因的功能,科学家们开发了缺失E1和E3基因的Ad5腺病毒载体。E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少,但是可以在HEK293包装细胞中得到补充,而E3基因不影病毒的包装。由于E1和E3基因的缺失,腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
腺病毒感染细胞的第一步是通过纤突蛋白与细胞表面CAR结合。腺病毒粘附后,五邻体蛋白上的精氨酸-谷氨酸-天冬氨酸(RGD)与细胞表面的整合素αvβ3和αvβ5结合并相互作用使腺病毒进入细胞。下图是腺病毒感染细胞的示意图:
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1、腺病毒感染的宿主细胞范围广,包括分裂细胞和不分裂细胞(某些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞除外)。
2、腺病毒感染效率高,在最佳感染条件下,感染率可达100%。
3、腺病毒的病毒滴度可以很高,纯化、浓缩后可达1012-13vp/ml(即1010-11pfu/ml)。
4、腺病毒易于扩增,而其他病毒比如慢病毒和腺相关病毒需要重新包装。
5、不整合到染色体中,无插入致突变性。
6、腺病毒理化性质稳定,4℃:数周。-80 ℃:数年。
Ad5腺病毒的高效感染依赖于靶细胞膜上的CAR和αvβ整合素,但是一些免疫细胞的细胞膜上却缺乏这些受体,如造血干细胞。这就使得研究人员寻找新的腺病毒血清型,最终发现F35血清型对造血干细胞有很强的靶向性,因此,嵌合型Ad5/F35应用而生。下面是Ad5 & Ad5/F35的结构示意图和区别:
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腺病毒种类 |
载体特点 |
功能 |
感染细胞受体 |
包装系统 |
AdV5 |
缺失E1和E3基因,允许插入长约8kb的外源基因 |
除免疫、血液类细胞外, |
CAR |
AdMax |
AdV5/F35 |
一个嵌合型腺病毒载体,主要结构是在AdV5的基础上,其受体结合位置的纤突(Fiber)改造成了F35型腺病毒(F35)的纤突(纤毛蛋白的Knob和shaft)。其细胞受体从AdV5的CAR变成了CD46,其他的基因仍旧保留AdV5载体的特性,能有效转导CAR表达不足的多种重要靶细胞,尤其是对肿瘤细胞及造型干细胞、间充质干细胞等有较高的感染效率。
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理论上感染所有有细胞核的细胞 |
CD46 |
AdMax |
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维真生物采用的包装系统包括了AdEasy和AdMax系统。其中,AdMax系统操作简便、重组效率高、获得的病毒产率也高,故成为目前腺病毒包装主要采用的系统。下图是AdEasy和AdMax系统的示意图:
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AdEasy系统 |
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AdMax系统 |
维真生物可以提供从腺病毒(AdV)质粒设计、构建、包装到表达分析的所有服务外包项目。而且,维真生物全套的腺病毒载体和表达系统可用于体内和体外表达human/mouse/rat ORFs,lncRNA,circRNA,shRNAs和CRISPR/gRNA。维真生物生产的腺病毒具有滴度高、纯度高和稳定性高的三高优点。下面是腺病毒从头合成的流程:
维真生物采用碘克沙醇密度梯度超速离心法对AdV病毒进行纯化。碘克沙醇是一种造影剂,已接受了临床检验。它具有非离子型、对细胞无毒和代谢惰性等优点。现在在病毒纯化方面应用广泛。它利用不同颗粒之间存在的沉降系数差,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带。下图是AdV病毒纯化后的示意图:
维真生物的AdV病毒采用多种方法来定量,主要包括QPCR法、孔稀释法和快速腺病毒滴度免疫检测法。下表是各方法的详情:
滴度标定法 |
原理 |
滴度单位 |
用途 |
QPCR法 |
用腺病毒基因组特异性引物进行QPCR。在定量曲线的线性范围内,Ct值与已知拷贝数质粒Ct值的比值,即为病毒基因组的初始拷贝数 |
vp/ml |
预制腺病毒库中 |
孔稀释法 |
数荧光 |
pfu/ml |
带荧光腺病毒的 |
免疫法 |
通过抗腺病毒抗体与感染了腺病毒供试样品的细胞结合,再用辣根过氧化物酶标记的二抗与一抗结合,经显色液显色,被感染的细胞显示出明显的棕色,通过计数及计算,测定腺病毒滴度 |
pfu/ml |
该方法不受荧光限制,适用于所有腺病毒滴度的测定 |
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1. 载体全: |
多种表达载体、多种标签载体和多种报告基因可供客户选择。 |
2. 货期短: |
Human ORF cDNA克隆可在2-3天穿梭至其他标签(3×Flag,Myc,Flag,HA,6×His,Flag & His,GFP,RFP等)的穿梭载体,个性化定做腺病毒; |
3. 纯度高: |
采用改良的碘克砂醇密度梯度超速离心法进行腺病毒纯化,对于动物没有任何毒性; |
4. 服务优: |
可根据客户具体实验,由公司专业技术人员提供载体构建方案,提供特殊定制服务。 |
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1. 您好,我感染的细胞是滋养层细胞,感染之前在六孔板中接种十万细胞,贴壁16h后加加入病毒(MOI=40),30h后细胞长满。我想咨询:病毒感染后实验组跟对照组相比细胞生产差不多,正常吗?
如果感染腺病毒的细胞状态与未感染组的细胞状态无明显差异,说明该病毒对细胞没有明显毒性作用。因此,未必是病毒数量不够。非腺病毒包装细胞被腺病毒感染后是不会有什么明显的特征。如果您在加入病毒的时候是提前把病毒用培养基稀释混匀之后再加入培养皿中的,那么高MOI值(导致细胞飘起来)对于目的细胞是比较高的。因此,您不用担心,可以先检测一下是否有蛋白表达。
2. 腺病毒感染细胞后是否需要更换新鲜培养液?
是否需要更换新鲜培养液需要看加入病毒的量,病毒量多的时候会对细胞有毒性:如果镜检时看到细胞状态有变化,需要在4-8h左右更换新鲜培养液;如果镜检时看到细胞状态无明显变化,那么病毒感染细胞之后就无需更换新鲜培养液。或者,如果您担心病毒长时间作用于细胞会有毒性,也可在12h后更换新鲜培养液。
3. 腺病毒感染细胞4-6h之后发现细胞全部飘起来了,请问这是怎么回事?
造成上述现象的原因主要有三点:
1)细胞的状态:感染之前铺板的细胞一定要使用健康的细胞;
2)实验操作不当:在加入病毒液的时候,如果局部病毒浓度过高会导致细胞死亡。因此,我们建议将病毒和培养基混匀之后再加入细胞中。
3)如果以上2点均无误,那就是加入的病毒量太大了。
4. 腺病毒感染细胞时,加入病毒量的依据是什么?
要得到最佳实验结果,确定腺病毒的最适用量是关键。量不足达不到100%感染效率;量太高则会对细胞产生毒性。那么如何确定呢?"感染复数"(MOI,multiplicity of infection)起着决定作用。MOI是是感染时病毒与细胞数量的比值。不同细胞系细胞表面的腺病毒受体数量不同,这就决定了不同细胞系的MOI会有所不同。通常,易感染细胞系所使用的MOI范围为10-100。 但是,对于某些难感染的细胞系,MOI可能需要高达1000。对于大多数细胞系来说,最佳MOI的范围很窄。我们建议您查阅文献或者在正式实验前,在目的细胞中用报告基因的腺病毒进行预实验摸最佳MOI。
最适病毒用量的计算公式:
病毒用量pfu=最佳MOI×细胞数目/病毒滴度
例如, 如果您目的细胞的最佳MOI=10,您需要感染106的细胞,那么您共计需要107pfu的病毒. 如果病毒滴度为1×1010 pfu/mL, 那么您实验需要的病毒量就是1ul.
5. 腺病毒感染细胞之后多久可以从基因水平和蛋白水平检测表达?如果蛋白是分泌性蛋白和非分泌性蛋白,检测时间是否有区别?
腺病毒携带的目的基因表达快。如果您想从基因水平检测基因的表达,那么在病毒感染细胞12-24h之间进行检测;如果您想从蛋白水平检测基因的表达,那么在病毒感染细胞48-72h之间进行检测。
对于分泌性蛋白和非分泌性蛋白,检测时间一样。如果担心蛋白分泌出来,也可以将培养基也一起带着做western blot。
6. 腺病毒毒种被细菌污染了,没有多余毒种,也没有构建好的载体,怎么办?
因为腺病毒的直径大小是90-100nm,而细菌的直径大小要大的多,可以用22um的滤器进行过虑。如果您的病毒量很低,担心过虑后损失太多,无法进行后面的扩增工作,您可以先用污染了细菌的腺病毒直接扩增,当然扩增的结果是得到了污染了细菌的腺病毒,但病毒的量会提高一些,这样再用22um的滤器进行过滤。
7. 如何鉴定腺病毒递送的目的基因?
可以按照如下方法进行鉴定:
①针对基因设计引物,同时作为扩增和测序引物;
②将病毒用蛋白酶K处理后做为模板,如果是未纯化的病毒还需要过纯化柱处理掉培养基的成分;
③以处理过的病毒为模板进行PCR;
④用PCR引物对PCR产物测序。
8. 慢病毒、腺病毒、腺相关病毒三种病毒有什么区别?如何选择?
对于转染困难的细胞,科研工作者通常会选择病毒来导入目的基因。目前,腺病毒、慢病毒和腺相关病毒是常用的病毒载体工具。那么如何选择适合您实验体系的病毒工具,请参考下面3种病毒工具的比较:
病毒表达系统 |
腺病毒 |
腺相关病毒 |
慢病毒 |
病毒基因组 |
dsDNA |
ssDNA |
ssRNA |
病毒外壳 |
无 |
无 |
具有包膜蛋白 |
基因组大小 |
38-39kb |
5kb |
9kb |
包装容量 |
7.5kb |
4.7kb |
6kb |
感染的细胞类型 |
分裂细胞和非分裂细胞 |
分裂细胞和非分裂细胞 |
分裂细胞和非分裂细胞 |
整合至宿主基因组 |
非整合 |
非整合 |
整合 |
表达丰度 |
高水平表达 |
高水平表达 |
中到高水平表达 |
表达时间 |
快(1-2天) |
1-2周(体内) |
慢(2-4天) |
外源基因持续表达时间 |
短暂 |
潜在的持久 |
长久 |
免疫反应 |
较高 |
极低 |
低 |
相对病毒滴度 |
10E10pfu/mL |
10E13VG/mL |
10E8TU/mL |
生物安全等级 |
BSL-2 |
BSL-2 |
BSL-2 |
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ORF现货腺病毒:
1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
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8. |
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9. |
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10. |
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11. |
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12. |
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13. |
MicroRNA现货腺病毒:
1. |
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2. |
基因过表达方面:
1. |
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2. |
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3. |
J Cell Physiol. (IF=5.546) . Wang M, et al. (2021) . Lack of Mof reduces acute liver injury by enhancingtranscriptional activation of Igf1. [过表达/干扰 急性肝损伤] |
|
4. |
Front Cell Dev Biol. (IF=5.201) . Gu J, et al. (2021) . CFTR Deficiency Affects Glucose Homeostasis via Regulating GLUT4 Plasma Membrane Transportation. [过表达 成肌细胞] |
|
5. |
Front Immunol. (IF=5.085) . Wu L, et al. (2021) . EZH2 Inhibition Interferes With the Activation of Type I Interferon Signaling Pathway and Ameliorates Lupus Nephritis in NZB/NZW F1 Mice. [过表达 狼疮肾炎] |
|
6. |
[4]Oxid Med Cell Longev. (IF=5.076) . Gao Y, et al. (2021) .Rap1GAP Mediates Angiotensin II-Induced Cardiomyocyte Hypertrophy by Inhibiting Autophagy and Increasing Oxidative Stress. [过表达 心肌] |
|
7. |
J Cell Mol Med. (IF=4.486) . Lei W,et al. (2021) . MARCH5 restores endothelial cell function against ischaemic/hypoxia injury via Akt/eNOS pathway. [过表达 心肌] |
|
8. |
J Biol Chem. (IF=4.238) . Zhang Z,et al. (2021) . The adaptor protein GIPC1 stabilizes the scavenger receptor SR-B1 and increases its cholesterol uptake. [过表达/干扰 肝脏] |
|
9. |
J Anim Sci Biotechnol. (IF=4.167) . Liu J, et al. (2021) . Comprehensive evaluation of the metabolic effects of porcine CRTC3 overexpression on subcutaneous adipocytes with metabolomic and transcriptomic analyses. [过表达 脂肪细胞] |
|
10. |
Aging. (IF=4.831) .Chen Y, et al. (2020). Mitophagy impairment is involved in sevoflurane-induced cognitive dysfunction in aged rats[自噬双标 术后认知功能障碍]. |
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11. |
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15. |
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16. |
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17. |
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18. |
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19. |
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20. |
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21. |
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22. |
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23. |
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24. |
基因沉默方面:
1. |
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2. |
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3. |
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4. |
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5. |
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6. |
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7. |
基因编辑方面:
1. |
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2. |
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3. |
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